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Angela Cuzzocrea
Nuovo Arrivato

Città: milano


4 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2008 : 13:02:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Angela Cuzzocrea Invia a Angela Cuzzocrea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao ho un grosso problema, lavoro con un plasmide commerciale al quale ho legato un inserto di mio interesse. Questa madre è stata diluita per ottenere una curva di taratura per un saggio in real time. Il problema è che i diversi punti della curva tendono, anche se stoccati in piccoli volumi e conservati a -20°C, a mostrare valori diversi di Ct. Premetto che tutte le curve vengono sempre analizzate con le stesse condizioni di Baseline, threshodl. Si ha l'impressione che il plasmide tenda a degradarsi per cui le copie/rxn misurabili sono ovviamnete sempre meno. Il mio palsmide è conservato in acqua sterile ed anche le diluizioni sono in acqua sterile. Qualcuno può aiutarmi in questo problema? non riesco più ad andare avanti. grazie a tutti

marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2008 : 15:55:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se puoi mettili nel -80. Io faccio così e non ho problemi, a patto di usare alquote sempre fresche (usa e getta).
So che è un pò un consiglio del cavolo perchè probabilmente se l'avessi avuto l'avresti già fatto!
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2008 : 19:22:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si può parlare di degradazione se tu lasci il DNA a temperatura ambiente per molto tempo ad un pH diverso da quello ideale, ma non se lo conservi a -20 e lo scongeli solo per pochi minuti.

Non è degradazione. è mancanza di completa dissoluzione di DNA.

Ad ogni ciclo di congelamento e scongelamento una quota sempre maggiore di DNA precipita e non torna in soluzione.

Soluzioni
1) invece di usare l'acqua distillata tal quale, usa TE pH 7.4 con 0.1 mM di EDTA per non disturbare la reazione. Il pH dell'acqua distillata scende sempre intorno a 5.5 quando è a contatto con l'aria e non è un buon pH per rispospendere il DNA dopo congelamento. pH 7,4 favorisce la dissoluzione del DNA e quindi dovresti avere meno problemi.

2) oppure se vuoi continuare ad utilizzare l'acqua, puoi scongelare e poi riscaldare il tuo campione a 55°C oppure 37°c per qualche minuto in agitazione lenta per favorire la solubilizzazione dei precipitati

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2008 : 19:56:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dimenticavo di dirti,

se sei convinto che sia degradazione oppure se lo vuoi escludere del tutto, prova a caricare il DNA su un gel di agarosio e vedi se compaiono strisce o altre bande che sono sintomo proprio di degradazione.

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marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2008 : 08:06:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma Angela, scolgeli lo stock ogni volta o lo hai aliquotato e ne usi una per ogni reazione? (Domanda fondamentale per dare senso a tutto)
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Angela Cuzzocrea
Nuovo Arrivato

Città: milano


4 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2008 : 08:54:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Angela Cuzzocrea Invia a Angela Cuzzocrea un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao grazie a tutti. il DNA è stato stoccato in aliquote di 30 ul. Ogni volta che devo fare un saggio ne prendo una e quello che rimane viene buttato, in questo modo è come se il DNA venisse scongelato una volta sola. La prova in TE1X è stata fatta ma non riesco ad avere valori uguali con le diluizioni in acqua. Per ciò che concerne la degradazione ho pensato anche io alla prova su gel che infatti farò oggi, mentre trovo utile pensare di scaldare a 37°C, non ci avevo pensato. Grazie a tutti vi farò sapere
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