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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2006 : 19:57:31
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Avrei due domandine...
1) I miei appunti nn sono chiari sullo screening bianco-blu...so solo che c'entra il gene per la beta gal, e che le colonie che la sintetizzano appaiono di colore blu. Ma come viene usata per selezionare gli organismi mutati?
2)Sulla FISH tutto ciò che sapete in generale come marcatura...
Grazie 
PS: Dimenticavo Il Chromosome Walking,come si fa da un locus camminando sul cromosoma a trovare il mio gene d'interesse?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2006 : 23:53:52
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Allora, lo screening bianco-blu ti serve x selezionare colonie di mutanti.
Innanzitutto serve un po' di teoria...
1) La beta-galattosidasi è un enzima che trasforma il lattosio in glucosio. L'enzima però non è specifico solo x il lattosio, ma può agire anche su composti simili, come ad esempio X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galattopiranoside) che viene idrolizzato dalla beta-gal rilasciando un composto blu.
2) La beta gal ha due domains principali, chiamati alfa e omega necessari perchè possa funzionare.
Ora, se prendi un E.Coli mutante che esprime solo il frammento omega questo non potrà idrolizzare X-Gal (o chi per esso). Se però lo trasformi con un vettore che esprima il frammento alfa, hai un fenomeno detto alfa-complementazione, per cui i due domini, anche se espressi separatamente, possono interagire e funzionare, come se avessi la beta-gal completa.
Il tipico plasmide che esprime il frammento alfa è il pUC. Il frammento è espresso sotto il controllo del promotore lac, quindi devi mettere un induttore per avere trascrizione: a tale scopo si usa di solito IPTG (isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside).
Il plasmide ha anche il gene x la resistenza all'ampicillina, per selezionare i mutanti.
Quindi, cosa succede:
hai il tuo ceppo che esprime solo omega.
1) se lo piastri su terreno con ampicillina muore tutto! 
2) se trasfetti con pUC e piastri su ampicillina ti rimarranno le colonie che hanno preso il plasmide.
3) se nel terreno, oltre all'ampicillina, ci metti anche X-Gal e IPTG le colonie saranno tutte blu.
E adesso viene il bello!
Il pUC ha il polylinker esattamente all'interno del frammento alfa. Quindi, se tu cloni qualcosa li dentro e trasfetti i tuoi bei batteriacci, poi li piastri con amp, X-Gal e IPTG vedrai:
- colonie blu che avranno il plasmide ma non il gene clonato all'interno
- colonie bianche che avranno il plasmide con il gene clonato all'interno
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Per il chromosom walking guarda qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=201
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2006 : 18:32:11
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Grazie infinite! Il topic sul chromosom walking mi ricordavo ci fosse, ma nn l'avevo trovato... |
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