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nitro.nory
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 10 settembre 2009 : 22:36:31
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Ciao a tutti,
purtroppo ho un problema con l'impostazione del threshold in reazioni di realtime PCR.
Dovrei sapere con esatezza come impostarlo perchè usando la realtime per diagnosi ho molti campioni che non so se considerare positivi o negativi.
Per esempio se imposto il threshold al valore di 0.3 alcuni campioni risultano negativi se abbasso il threshold anche a 0.1 ecco che gli stessi campioni risultano positivi seppur a valori di Ct alti.
Qualcuno può aiutarmi ? ho una 7300 dell'applied biosystem.
Grazieeee
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2009 : 02:20:18
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L'impostazione del threshold manuale non è una cosa facilissima.
Detto in poche parole deve stare nella fase esponenziale delle curve dei tuoi amplificati, però non è facile trovare il punto dove vada bene per tutte le curve. Il modo migliore per vederlo visivamente è visualizzare le curve in modalità logaritmica e mettere la soglia nella parte "retta" delle curve, dovresti anche vedere che le curve siano abbastanza parallele tra loro.
Però prima di impostare la soglia devi controllare che la baseline sia adeguata, lo strumento (credo lo faccia anche il tuo) sceglie una baseline tra 3-15 cicli, ma dovresti vedere a che ciclo si amplifica il campione più espresso, una baseline ideale è circa 2 cicli prima rispetto all'amplificazione del tuo campione più espresso, questo vuol dire che se hai ad es. un campione che esce al 13 ciclo, non va bene come baseline e devi cambiarla manualmente.
Stabilita la baseline, la soglia deve essere almeno 10 deviazioni standard superiore rispetto alla baseline, in genere la macchina te ne imposta una in automatico calcolando 10 deviazioni standard sopra la baseline. Quindi se questa è impostata correttamente in genere va abbastanza bene. Se devi spostarla a mano tieni in considerazione quanto detto sopra:
- deve essere 10 deviazioni standard sopra la baseline
- deve essere nella fase esponenziale (lineare in modalità logaritmica)
un altro criterio che ci può applicare, fermi restando i precedenti, è quello di guardare che nel punto dove si mete la soglia la ripetibilità dei replicati sia massima.
Comunque non puoi impostarla così "a caso" ad es.
Citazione:
Per esempio se imposto il threshold al valore di 0.3 alcuni campioni risultano negativi se abbasso il threshold anche a 0.1 ecco che gli stessi campioni risultano positivi seppur a valori di Ct alti.
non ha alcun senso! Non importano i numeri 0.3 o 0.1, che variano da esperimento a esperimento ed estrapolati dal loro contesto (cioè come sono le curve) non hanno alcun significato, ma bisogna considerare le cose che ti ho scritto prima.
Nel caso avessi dei problemi potresti provare a sentire il supporto tecnico Applied e vedere se ti mandano, o se ti fanno almeno parlare con uno specialist.
Spero di essere stata abbastanza chiara vista l'ora!
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nitro.nory
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2009 : 14:20:24
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Ti ringrazio moltissimo per le preziose indicazioni !!
Ho messo la modalità lineare e con questa modalità riesco a visualizzare la fase della curva "retta", in questo modo è facile capire quando comincia la fase esponenziale. Nella modalità logaritmica vedo la classica curva.
Volevo chiederti cosa significa impostare la threshold 10 deviazioni standard sopra la baseline, e come faccio a calcolarle.
Grazie ancora |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2009 : 18:51:00
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Beh dovresti andare a vedere la fluorescenza nei cicli in cui hai impostato la baseline, calcolarti la media e la deviazione standard e moltiplicarla per 10, quello è il punto "ideale" dove va la soglia. Ma in realtà sono conti che ti fa il programma in automatico.
Detto in poche parole, ma prendilo con le molle perché non è una definizione precisa, significa che deve essere abbastanza lontana dal rumore di fondo.
Tu più che basarti sui conti, se per qualche motivo ritieni che la soglia che ti dà in automatico sia sbagliata devi valutare rispetto a come sono le tue curve.
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2012 : 08:32:42
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[la soglia deve essere almeno 10 deviazioni standard superiore rispetto alla baseline]
ciao! mi inserisco in questa discussione per chiederti se per cortesia sapresti farmi un esempio pratico di cosa intendi e di come si calcola la threshold rispetto alla baseline..
saresti gentilissima a illuminarmi.grazie mille per la tua disponibilità. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2012 : 17:10:00
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| C'è scritto tutto nella risposta sopra! |
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Gabry
Nuovo Arrivato
Prov.: Ancona
Città: santa maria nuova
64 Messaggi |
Inserito il - 26 luglio 2012 : 12:26:50
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| ma se a te interessa il DCT non dovrebbe interessarti dove posizionare di preciso il treshold. è ovvio che nella stessa real-time dovrai avere sia gene target che gene housekeeping. |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 26 luglio 2012 : 14:15:24
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Citazione:
Messaggio inserito da Gabry
ma se a te interessa il DCT non dovrebbe interessarti dove posizionare di preciso il treshold. è ovvio che nella stessa real-time dovrai avere sia gene target che gene housekeeping.
allora mi sa che non mi è chiaro qualcosa o mi manca un passaggio perchè non capisco la tua risposta... ;( |
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Threshold Real-time PCR
Didattica
