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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
 Inserito il - 17 aprile 2004 : 09:13:29
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Vi segnalo questa meravigliosa animazione (o serie di animazioni).
Prodotta da Nature,
spiega il processo della RNAi in modo chiaro e soprattitutto visuale!
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
[io con l'ADSL non ho avuto problemi, ma potrebbe essere un po' lento a caricare: ma ne vale la pena!]
Riky
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fatalerror
Nuovo Arrivato
Città: bruxelles
20 Messaggi |
 Inserito il - 04 maggio 2004 : 20:10:39
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ma come applicarlo?diciamo che voglio vedere gli effetti dell'assenza di una certa proteina X. inserisco nel mio plasmide la sequenza necessaria, se già so qual è il frammento della sequenza della prot necessario (xchè ci vuole un frammento e nn tutta la sequenza), sennò vado a casaccio inserendo sempre frammenti diversi finchè nn trovo quello che funziona. transfetto il plasmide, gli lascio il tempo di produrre l'RNAi, poi faccio un estrazione totale, un western x verificare l'assenza di X e le analisi che mi servivano...xò xchè funzioni bene ci vorrebbe forse lo stesso promotore di X o secdondo voi va bene qualsiasi promotore? e l'effetto sarebbe costante nel tempo?chi mi dice che l'RNAi sarà prodotto in quantità sufficiente?
magari sono domande stupide...scusate |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2004 : 20:35:32
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In realtà la cosa non è ancora ben definita, in quanto non sono chiarissimi i meccanismi molecolari dell'RNA interference.
In pratica ci sono diversi metodi per utilizzare l'RNAi, ma comunque in tutti i metodi devi provare a fare interferenza con ALMENO 20-30 sequenze di 18-20bp. Ci sono delle guidelines su come scegliere le sequenze (es. se non ricordo male devono iniziare con AA, avere una certa % di GC etc.), ma non è ancora chiaro perchè una sequenza vada meglio di un'altra. A questo punto puoi procedere facendo Western anche se non è il metodo migliore, oppure usare i kit a fluorescenza fatti apposta per fare lo screening delle sequenze.
Una volta trovata la sequenza ottimale (se trovi una buona sequenza puoi addirittura arrivare a 98% o più di soppressione del gene) puoi trasfettare le tue cellule.
Ci sono 3 metodi "classici" x fare RNA interference, ciascuno con i suoi vantaggi e svantaggi e adesso stanno uscendo diversi metodi alternativi a questi (che comunque si basano su questi 3):
1) Trasfezione diretta con RNAds
2) Trasfezione di un plasmide contenente 2 sequenze che codificano per il senso e l'antisenso dell'RNA che si vuole produrre (o due plasmidi ciascuno con una sequenza). Una volta trasfettata, la cellula produrrà i 2 strand dell'RNA che si uniranno a formare RNAds.
3) Trasfezione con un plasmide contenente una sequenza che codifica per uno shRNA (small hairpin RNA), cioè un RNA unico che contiene la sequenza senso, uno spacer (5-6 basi) e la sequenza antisenso. Questo RNA avrà una struttura a "forcina", poichè il senso e l'antisenso si uniranno.
Per quanto riguarda la stabilità dell'inibizione, non so se si riesca a fare RNA interference in modo stabile. Sicuramente so l'effetto massimo si ha 24-48 ore dopo la trasfezione.
Per quanto riguarda i promotori (a meno di non usare il metodo 1), in generale tutti i kit che ho visto usano il promotore di U6 o cmq promotori simili (questo anche per garantire che il kit funzioni ugualmente in tutte le linee cellulari).
nICO |
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Kia
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2005 : 19:56:09
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Ciao a tutti!
Qualcuno mi sa dire il meccanismo d'azione e le differenze tra siRNA, stRNA,miRNA e shRNA?Grazie mille! |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2005 : 15:18:31
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| secondo voi l'RNA interference potrà entrare un giorno della dianostica? magari non ora ma secondo me si. |
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EvaHerzigova
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2005 : 20:03:48
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Chick80,Atreliu e kiunque possa aiutarmi ho da porvi 1 quesito...ma questo processo dell'RNA interference esiste normalmente anke in natura?o si verifica solo in seguito a queste applicazioni e trasfezioni?E se dovesse verificarsi normalmente qndo succede?L' RNA di solito nn è a singola elica?Come è possibile ke si generi il double-strand?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2005 : 22:55:01
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L'RNA interference esiste in natura: è stato scoperto nelle piante ma esiste anche nelle cellule animali (che infatti possiedono il RISC, il complesso di proteine reclutato dal dsRNA).
In natura l'RNA è normalmente single-strand, tuttavia diversi virus hanno un genoma a RNA double-strand o cmq producono RNAds durante il loro ciclo replicativo. Quindi l'RNAds è un segnale di infezione virale e il processo di interference serve alla cellula x combattere il virus.
Bisogna anche dire che l'interferenza mirata ce l'hai usando sequenze di circa 20bp. Sequenze più lunghe, infatti, provocano una generale distruzione di tutto l'mRNA cellulare, oltre a stimolare la produzione di IFNgamma, una citochina proinfiammatoria rilasciata, appunto, in caso di infezione virale.
nICO |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 04 marzo 2005 : 23:54:22
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beh ci sono anche sistemi di interferce cellulari endogeni, ke ultimamente sono molto di moda: i NAT(natural antisense)RNA e i microRna/miRNA (quest'ultimi passano smepre per risc e dicer, non è dsRNA vero e proprio, ma stem-loop) che sono coinvolti nella regolazione dell'espressione genika.
ho qualke review carina su questi due se interessa.
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piciocca
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
1 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2005 : 02:23:11
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| Quindi fatemi capire...siccome il dsRNA è anomalo,e normalmente verrebbe degradato,quando applichiamo la tecnica dell'RNAi dobbiamo cercare di trasformare l'RNA single-strand,responsabile della codifica di qualche proteina strana,in un dsRNA di modo che venga distrutto? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2005 : 13:08:05
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il ds RNA è riconosciuto come anomalo a seconda delle dimensione ke ha,
come ha già detto Chick un dsRNA + lungo di 30 bp genera nelle cellula di mammifero(tranne ES di topo credo) la risposta dell'interferone/RNAsiL, in quanto la cellula lo riconosce come un genoma virale, causando quindi un silenziamento dell'espressione generalizzato e non sequenza specifico. Per ovviare questo problema, le applicazioni di RNA interference in mammifero prevedono l'utilizzo di sequenze non + lunghe di 28b, con promotori per polIII(appunto u6 o h1)
Per un espressione + stabile si dovrebbe ricorrere a vettori retro/lenti virali, disegnati essenzialmente come ha descrirtto Chick
Il messaggero target non dev'essere per forza una proteina "strana", l'interference è molto usato per esperimenti di knocking-down.
i miRNA a cui mi riferisco sono codificati da geni endogeni della cellula, sono un meccanismo di controllo dell'espressione a livello di mRNA.La dimensione di un miRNA maturo è di circa 22 bp, sono trascritti da polII e si possono trovare nel genoma o in posizione intergenica o intragenica(in organismi inferiori anke in cluster). Il loro pathway prevede prima di Dicer/RISC un passagio per un enzima miRNA-specifico nucleare: DROSHA.
Anche se il mekkanismo di silenziamento è lo stesso i miRNA a differenza dei siRNA possono dare etero-silencing(cioè agiscono su sequenze diverse da quelle ke li generano) mentre i siRNA danno solo auto silencing.
Personalmente, penso ke il confine fra miRNA e i siRNA prodotti in lab sia alquanto labile. |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2005 : 21:36:35
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| ragazzi sul gene IV c'è rna interference? non riesco a trovarlo. quale libro mi sapete indicare? ciao |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 05 aprile 2005 : 22:49:56
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| Mi sembra difficile che sul gene IV ci sia. Siamo arrivati al VI e non mi è parso di vederlo. Cmq, io l'ho studiato da delle fotocopie della rivista Science, se non sbaglio del 2001. Se ti servono fammelo sapere! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2005 : 23:44:44
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Genes l'ho visto da un bel pezzo nell'VIII edizione!
c'era un focus di nature sul silencing
cmq ho delle review se servono |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2005 : 00:18:37
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Siamo arrivati al VII?
A settembre stavamo ancora al VI o almeno quello vendevano... |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2005 : 00:26:10
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no infatti scusate intendevo il gene VI e non il IV(mi sono sbagliata ) cmq se avete del materiale mandate pure è tutto ben accetto!! cmq in america è uscito il gene VIII |
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Annagaia
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2005 : 13:13:58
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| ciao...avrei bisogno di notizie su protocolli, dove ci siano scritti i passaggi, i materiali con il loro scopo, per attuare l'RNAi..e vorrei sapere se qualcuno attua dopo il silenziamento l'OGD, ovvero ischemia per mancanza di ossigeno e glucosio...grazie. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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pallolicus
Nuovo Arrivato
Prov.: Benevento
Città: airola
67 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2006 : 18:12:58
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Citazione:
Messaggio inserito da Kia
Ciao a tutti!
Qualcuno mi sa dire il meccanismo d'azione e le differenze tra siRNA, stRNA,miRNA e shRNA?Grazie mille!
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
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@GIUSY@
Nuovo Arrivato
Città: AVELLINO
1 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2008 : 18:37:59
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| DOPO UN RNAi COSA SI FA PER VEDERE SE IL TUTTO è RIUSCITO? SE IL MIO GENE è STATO SILENZIATO? GRAZIE |
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rafa_nadal
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2008 : 19:45:32
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Citazione:
Messaggio inserito da @GIUSY@
DOPO UN RNAi COSA SI FA PER VEDERE SE IL TUTTO è RIUSCITO? SE IL MIO GENE è STATO SILENZIATO? GRAZIE
Per vedere se il gene è stato silenziato puoi andare a vedere sia la non trascrizione (tramite Northern blot o RT-PCR) oppure puoi vedere la non espressione, quindi la non presenza della proteina (ad es tramite Western blot) |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2008 : 19:46:04
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Magari potresti aprire un altro thread ed essere più precisa, cmq
Hai a disposisione diverse possibilità:
- controllare la quantità di trascritto (RT-PCR, o northern se devi pubblicare)
- controllare la quantità di prodotto (se è proteico e se hai l'Ab puoi fare un western )
- controllare il pattern cellulare (ad es. se è un enzima,
vai a vedere se l'attività è calata, oppure se c'è stato
un accumulo di substrato ed una riduzione del prodotto)
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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steel85
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2010 : 12:00:35
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Ciao a tutti,
ho una domanda di carattere tecnico.
Premetto che personalmente non ho mai utilizzato protocolli di RNAi e adesso mi trovo nella circostanza di doverlo fare.
Detto ciò vorrei sapere se c'è qualche anima pia che si è trovata a utilizzare il sistema della dharmacon di cui allego link.
http://www.dharmacon.com/home.aspx
Mi occorrerebbe una spiegazione del protocollo che qui si usa in quanto non sono sicuro di avere appreso bene e inoltre vorrei qualche info sulla bontà del sistema stesso.
Saluti
Ste |
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ilaria_gen
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2012 : 12:48:57
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Salve a tutti,
sono nuova anke se da anni leggo le vostre discussioni.
in merito all'RNAi qualcuno sa indicarmi un buon centro estero dove lo praticano in ambito vegetale?
grazie! |
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Discussione |
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Rna Interference
