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Mosis
Nuovo Arrivato
Città: torino
3 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2009 : 18:47:50
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Ciau a tutti...
ho finalmente iniziato a lavorare per la mia tesi...non senza un bricolo di emotion...cmq
mi si presenta già da subito il primo problems di una certa rilevanza:
ho dei campioni di tessuto e sto facendo l'estrazione dell'RNA tramite metodo con il triazol:
- Tessuto + sferette + triazol (con fenolo a pH 8)--> tyssiue lyser
- Cloroformio->vortex->centrifugazione
- Separazione nella eppendorf-> l'RNA (sopra)-fase org con DNA (sotto)
a questo punto prendo la fase con RNA e continuo l'estrazione.
ma per il lavoro che devo fare avrei bisogno di estrarre in contemporanea il DNA, è possibile estrarlo dalla fase organica?
Ci sono dei protocolli che mi permettono di fare ciò?!?
Premetto che per ora ho la sola fase organica+DNA conservata a -20.
vi ringrazio in anticipo a tutti...
Simone
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"L'uomo vive e muore dentro quel che vede....ma vede solo quel che sogna..."
P. Valery |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 19:53:41
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Citazione:
ma per il lavoro che devo fare avrei bisogno di estrarre in contemporanea il DNA, è possibile estrarlo dalla fase organica?
Ci sono dei protocolli che mi permettono di fare ciò?!?
certo! Il protocollo lo trovi direttamente sul manuale dei TRIzol (che si chiama così appunto perchè permette di estrarre: RNA, DNA e Proteine)
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/15596018%20pps%20Trizol%20Reagent%20061207.pdf
Non so però se il congelamento della fase organica ti possa creare dei problemi, in ogni caso io farei scongelare lentamente e poi ricentrifugherei.
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Mosis
Nuovo Arrivato
Città: torino
3 Messaggi |
 Inserito il - 02 dicembre 2009 : 08:39:00
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Sei stata gentilissima...ho letto il protocollo...solo una parte non mi è molto chiara..
mi dice di fare due lavaggi con una soluzione al 0.1M di sodiocitrato.. .no problema..
dopo questi lavaggi, nn lo dice..ma immagino che si debba eliminare la sol di lavaggio vero?!? il pellet dovrà essere completamente asciutto...?
ho messo la parte del protocollo in questione qua sotto..
grazie...
PS..hai un nick name bellissimo...eh-eh...
DNA WASH
Remove the phenol-ethanol supernatant, and if desired, save it for protein isolation.
Wash the DNA pellet twice in a solution containing 0.1 M sodium citrate in 10% ethanol.
Use 1 ml of the solution per 1 ml of TRIZOL® Reagent used for the initialhomogenization.
At each wash, store the DNA pellet in the washing solution for 30 minutes at 15 to 30°C
(with periodic mixing) and centrifuge at 2,000 × g for 5 minutes at 2 to 8°C. Following
these two washes, suspend the DNA pellet in 75% ethanol (1.5-2 ml of 75% ethanol per 1
ml TRIZOL® Reagent), store for 10-20 minutes at 15 to 30°C (with periodic mixing) and
centrifuge at 2,000 × g for 5 minutes at 2 to 8°C.
An additional wash in 0.1 M sodium citrate-10% ethanol solution is required for large pellets
containing > 200 #956;g DNA or large amounts of a non-DNA material. |
"L'uomo vive e muore dentro quel che vede....ma vede solo quel che sogna..."
P. Valery |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 dicembre 2009 : 16:38:18
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Citazione:
Messaggio inserito da Mosis
mi dice di fare due lavaggi con una soluzione al 0.1M di sodiocitrato.. .no problema..
dopo questi lavaggi, nn lo dice..ma immagino che si debba eliminare la sol di lavaggio vero?!? il pellet dovrà essere completamente asciutto...?
Si certo le soluzioni di lavaggio (questo vale per tutti i protocolli) vanno poi eliminate.
Non è necessario far asciugare completamente il pellet perchè in ogni caso poi continui con Etanolo 75%, solo dopo aver eliminato questo e prima di risospendere il pellet in acqua o TE devi farlo asciugare (ma non seccare troppo!)
Citazione:
Messaggio inserito da Mosis
PS..hai un nick name bellissimo...eh-eh...
Grazie!  |
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