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zelos1
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Prov.: Palermo
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31 Messaggi |
 Inserito il - 12 febbraio 2010 : 11:06:39
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Salve a tutti
Ho un problema con un gel di agarosio: ho congelato a -20 due bande per estrarre il DNA il giorno dopo.
Sto tenendo ora il gel in eppendorf a bagno in acqua a 60 gradi da quasi un ora, e non si liquefa! Mi sorge il dubbio che non si possa fare..qualcuno ha mai provato??
Grazie in anticipo
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
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31 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2010 : 12:09:57
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| Alternativamente-c'è una maniera di recuperare il DNA dal gel non liquefatto, quindi la fettina ancora solida? |
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jeje
Nuovo Arrivato
52 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2010 : 19:05:50
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| ciao io usavo un kit quiagen e usavo direttamente agorosio solido.ma non congelato! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2010 : 19:40:22
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Ma perchè l'hai congelato? Non ti conveniva conservarlo a 4°C fino al giorno dopo?
Sinceramente io non ho mai congelato un gel di agarosio.
Comunque esistono vari kit per estrarre il DNA da gel di agarosio, esistono anche protocolli manuali ma non ne ho qua dovrei cercare. |
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 03:23:47
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In realtà è stato un errore, andava conservato a 4°, invece l'hanno messo ha -20!!
Cmq lunedì provo di nuovo a scioglierlo a 60° come da protocollo, se non funziona butto tutto e rifaccio!!
Grazie per l'aiuto comunque!
A presto
PS per gfpina: conosci una certa Cinzia che lavora ad Helsinki??
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 10:17:09
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Beh comunque sembra che si possa, qua descrivono un protocollo: Recovery of polymerase chain reaction products from frozen agarose gels
Fammi sapere nel caso tu non possa accedere all'articolo, in ogni caso non dicono niente di speciale, lo fanno semplicemente scongelare a Tamb e poi utilizzano un kit per l'estrazione come da gel fresco.
Citazione:
Messaggio inserito da zelos1
PS per gfpina: conosci una certa Cinzia che lavora ad Helsinki??
No mi spiace non la conosco, ma di Italiani qua ce ne sono molti. |
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 10:56:36
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No, non posso accervi, l'ho già richiesto dalla biblioteca ma ci mette un po' di tempo ad arrivare! Comunque se la procedura è sempre quella..niente di nuovo!
Grazie gfpina, chiedevo perchè Cinzia era una mia collega di studi, e per ora in erasmus dovrebbe esserci anche una certa Erika.
Se le vedi, salutamele, da parte di Manuel
Ciao ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 11:06:38
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Beh comunque te lo invio tramite messaggio privato.
Mi spiace ma non credo incontrerò mai né Cinzia né Erika, oggi è il mio ultimo giorno ad Helsinki, peccato!
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 12:31:50
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certo che si può congelare un gel d'agarosio. per estrarre il dna devi semplicemente aggiungere il buffer n.1 di un qualsiasi kit per estrazione e metterlo a 50 gradi per 7 minuti.
poi colonnina d'estrazione e via. non ci credo che nel tuo lab nessuno ha un qualsiasi kit per purificare frammenti di dna. e cmq è meglio metterlo a -20 che a 4 gradi.
ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 13:07:45
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Sinceramente io non lo avevo mai sentito, ho sempre estratto da gel freschi che comunque credo sia la cosa migliore, ma anche a leggendo l'articolo pare che non ci sia una sostanziale perdita di DNA.
Io comunque preferirei nel caso conservare i prodotti di PCR congelati che non il gel. 
Il fatto di metterlo a 4°C comunque va bene se lo devi tenere solo overnight, io ho conservato gel a 4°C o/n per problemi tecnici al transilluminatore e le bande il giorno dopo erano comunque belle. |
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 14 febbraio 2010 : 15:31:54
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In realtà il kit dice di liquefare il gel e dopo aggiungere il buffer uno. Quello che usiamo è quello della "EZNA", ha sempre funzionato bene..Comunque domani proviamo e vediamo che succede.
Grazie sempre per le risposte!!
Manuel |
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zelos1
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: Palermo
31 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2010 : 16:07:49
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ok, per la cronaca funziona!
Mancava il buffer uno per farlo scogliere..grazie a tutti,
Ciao |
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2010 : 18:29:20
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noi usavamo il kit quiagen ma quando lo abbiamo terminato e ci sono finiti i soldi abbiamo applicato nuovo protocollo:
La banda contenente lamplificato è stata escissa con bisturi e il DNA eluito in 150 µl di acqua mQ e lasciato a 4°C per 3 giorni.
Quindi ho aggiunto 75 µl di Eluition Buffer 2X (Na-acetato 0.5M a pH7 e EDTA 1mM a pH 8), ho prelevato la soluzione a cui ho aggiunto isopropanolo-potassio acetato e ho lasciato per 2 ore a -20°C; ho centrifugato a 13.000 rpm per 15 min; al sedimento ho aggiunto alcool al 70% e lasciato la soluzione per 2 ore a -20°C. Dopo essiccamento in Savant al sedimento è stato aggiunto 100 µl di acqua mQ e un volume di cloroformio-alcool isoamilico, 24:1 e ho centrifugato 10 min a 12.000 rpm, quindi ho prelevato il surnatante e ad esso ho aggiunto 2 volumi di alcool 100% a freddo. Ho velocemente agitato la soluzione sul vortex e posto a -80°C per due ore. Ho quindi centrifugato a 12.000 rpm per 10 min, lavato in alcool 70% a freddo, centrifugato per 10 min a 12.000 rpm, decantato e savantato. Ho reidratato con 20 µl di acqua mQ ed effettuato lettura al nanodrop. |
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2010 : 18:33:19
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| scusate se ho fatto copia incolla dalla mia tesi e magari ci sono alcune cose che possono nn essere pertinenti, tipo lettura al nanodrop ecc. cmq questo protocollo fu usato da noi... ora mi sto rendendo però conto che tu intendevi che mettevi a -20 la banda, quindi ops... sorry per protocollo poco pertinente! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2010 : 19:19:56
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Beh se vuoi comunque il protocollo puoi inserirlo nella sezione protocolli: http://www.molecularlab.it/protocolli/
potrebbe comunque risultare utile a qualcuno!  |
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prossima biologa
Utente Attivo
1437 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2010 : 21:03:05
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| ok gfpina lo posto subito!! |
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Gel di agarosio congelato!!
Didattica e Relazioni
