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clelia89
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2010 : 10:18:09
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salve a tutti, mi sono appena iscritta perchè ho trovato che questo forum sia molto interessante e di grande aiuto! 
volevo chiederervi un informazione dato che ho un esame fra pochi giorni e sto con l'acqua alla gola.
Per quanto riguarda i geni housekeeping io ho letto da voi già alcune discussioni ma non mi sono state tanto chiare..ho capito che sono dei geni espressi costitutivamente nelle cellule ma non mi è ben chiaro la loro funzione in laboratorio. Quindi la mia domanda è.. quando e come vengono utilizzati? Dopo PCR quantitativa e anche PCR classica o anche nel Northern blotting? se mi potete dare delle delucidazioni in merito a questo argomento ve ne sarei grata perchè su internet c'è scritto poco. grazie in anticipo e auguri a tutti di buona e felice Pasqua!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 11:22:03
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Beh, l'idea è che il gene housekeeping è espresso costitutivamente e ad un livello fisso dalla cellula. Ti serve quindi ad es. per normalizzare le misure di realtime (lo stesso discorso si può fare per le "proteine housekeeping" nel WB).
Faccio un esempio semplificato
Ad es. diciamo che tu misuri la quantità del gene X in cellule controllo e cellule trattate e vedi che il trattamento raddoppia la trascrizione di X.
Concludi allora che il tuo trattamento aumenta la trascrizione di X? No!
Vai a vedere la quantità del tuo gene hk e hai 2 casi:
1) il gene hk è rimasto allo stesso livello nelle due condizioni.
2) anche il livello di gene hk è stato raddoppiato (o comunque modificato)
Nel primo caso puoi dire che il tuo trattamento ha in effetti agito su X, nel secondo caso invece puoi dire che il trattamento ha semplicemente aumentato la trascrizione di RNA in generale (es. un trattamento che induce proliferazione) e non hai un effetto specifico su X.
La cosa è un po' più complessa nella realtà, ma l'idea di base è questa. |
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clelia89
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 11:51:35
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grazie per la risposta...quindi se ho ben capito il gene housekeeping viene utilizzato come controllo endogeno..e deve apparire a una stessa concentrazione e allo stesso livello. se la concentrazione del gene controllo è minore, allora sono incorsi errori , giusto?
ma viene utilizzato solo nella real time? |
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clelia89
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 11:52:53
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ah scusami...hai detto anche nel WB.
grazie davvero..ora mi è più chiaro il concetto. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 12:34:45
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Citazione:
se la concentrazione del gene controllo è minore, allora sono incorsi errori , giusto?
Non è necessariamente un errore. Solo che se l'hk non rimane fisso allora devi interpretare in modo diverso i tuoi dati (e magari trovare un altro hk che resta stabile) |
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clelia89
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2010 : 12:48:11
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ok ho capito meno male... grazie ancora!
quindi rapportandolo alla quantificazione relativa nella real time..io paragono il ct del prodotto amplificato e il ct dell'hk per normalizzare il target...? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 13:49:51
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Esatto, immagina ad es.:
controllo Ct(hk) = 10
controllo Ct(gene X) = 18
X/hk = 1.8
trattato Ct(hk) = 10.3
trattato Ct(gene X) = 16
X/hk = 1.55
In questo caso hai una diminuzione della trascrizione di X (ovviamente bisognerebbe avere dei triplicati, avere più campioni, fare dei test statistici etc etc etc)
Se invece avessi
controllo Ct(hk) = 10
controllo Ct(gene X) = 18.5
X/hk = 1.85
trattato Ct(hk) = 8.7
trattato Ct(gene X) = 16
X/hk = 1.84
In questo caso come vedi, nonostante X diminuisca in valore assoluto non diminuisce in rapporto all'hk.
Nota che vari autori suggeriscono la normalizzazione con almeno 3 diversi hk o anche con il numero di cellule o la quantità totale di RNA (o rRNA).
Qui trovi un sacco di materiale a riguardo: http://www.gene-quantification.de/hkg.html |
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clelia89
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2010 : 16:20:38
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aaaah ecco quindi devo inserire 2 controlli..ora è tutto più chiaro.
grazie infinite davvero! scusa se ti ho fatto tutte queste domande ma volevo dei chiarimenti approfonditi. grazie ancora! |
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geni housekeeping
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