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koise
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
9 Messaggi |
 Inserito il - 28 maggio 2010 : 10:10:28
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Salve a tutti, vorrei un chiarimento su una domanda che la mia prof. ha fatto durante un esame:
se taglio il dna con un enzima di restrizione che mi lascia delle sticky ends perchè è possibile marcare solo se ho una 5'-protruding mentre non posso farlo se ho la 3'-protruding?
Ringrazio chiunque sappia darmi una risposta!
Francesca
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 10:39:11
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Immagino che tu stia parlando di labelling con nucleotidi modificati (radioattivi, digox etc).
Se lasci la estremità 5' protruding, vuol dire che avrai un innesco 3'-OH libero, da sfruttare con la polimerasi (per esempio T4 o Klenow): questa riempirà il gap con i nucleotidi mancanti che tu gli fornisci (tra i quali ci metti per esempio un minimo di nucleotide radioattivo). Il risultato finale è estremità blunt marcata radioattivamente.
In realtà però io so che puoi fare la stessa cosa con estremità 3' o blunt (una cosa che ho letto sul Maniatis): metti la polimerasi t4 (o anche la klenow, che però è un pò meno efficiente per l'attività 3'->5' esonucleasica) e un nucleotide soltanto (per esempio dTTP radioattivo): in questo caso l'attività esonucleasica 3'->5' ha il sopravvento sulla polimerasica, e quindi la polimerasi degrada l'estremità blunt (o la 3' tail) finchè non trova un nucleotide complementare a quello che tu hai fornito (quindi finchè nn trova una A sullo stampo). A questo punto ci piazza la T radioattiva marcando il DNA.
Questo sapevo e ho letto sul maniatis (ce l'ho qui sottomano per sicurezza), non so cosa ti abbia detto la prof a lezione. Magari ci penserei un pò prima di scrivere cose in più che lei nn ha spiegato...
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koise
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
9 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 10:59:16
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si, ovviamente intendevo la marcatura con nucleotidi modificati, scusami.
Grazie per la risposta, era quella che più o meno avevo immaginato per quanto riguarda le 5' protruding, ma a lezione la cosa che mi hai spiegato tu per le 3' non l'ha nominata proprio, penso che in caso di domanda simile non gliela nominerei affatto!
Grazie ancora!
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esame biologia molecolare, marcatura dna
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