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chica3


45 Messaggi
Inserito il - 10 giugno 2010 : 12:28:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pin  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Pin Invia a Pin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ora pongo una domanda che sicuramente sembrerà stupida...
Sto studiando la tecnica del southern blot e sono arrivato al momento dell'ibridizzazione della sonda di DNA con i frammenti precedentemente trasferiti per capillarità su uno strato di nitrocellulosa.

Leggo dagli appunti che ho che è possibile "regolare" la stringenza dell'ibridizzazione dato che la specificità con cui una sonda lega il frammento è in funzione della temperatura; alte temperature = elevata specificità / basse temperature = bassa specificità.

Per quello che rigurda invece il BLOCKING leggo che è un' operazione che viene eseguite al fine di evitare che ci siano delle ibridizzazioni aspecifiche nelle regioni tra le bande (del foglio di nitrocellulosa). Non riesco a capire però come viene effettuata questa operazione dato che sui miei appunti c'è una frase troncata : "BLOCKING: per evitare che la sonda leghi gli interstizi tra le bande in maniera aspecifica tutti gli spazi non occupati da DNA in analisi vengono saturati con..." (???)
Ma gli spazi tra le bande sono costituiti esclusivamente da nitrocellulosa senza materiale genetico giusto? E le sonde sarebbero capaci di legare tali spazi?

L'operazione di blocking si fa prima dell'immersione del foglio nella sonda?

Grazie in anticipo!

"Non è mai tardi per tentar l'ignoto. Non è mai tardi per andar oltre."

Gabriele D'Annunzio

Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 10 giugno 2010 : 13:29:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando


allora,
1) fai un gel di agarosio e fai migrare il tuo DNA... fino a quanto serve poi STOP
2) denaturi il DNA a singolo filamento e lo rompi con un cambio di pH
3) trasferisci per capillarità il DNA dal gel al foglio di nitrocellulosa. Le cariche positive della nitrocellulosa attacca bene il DNA negativo
4) Fai un Cross-link per fissare il DNA alla nitrocellulosa. Tipo metti gli UV che forma legami crociati covalenti tra il DNA ed il filtro

5) bagni il filtro di nitrocellulosa con una soluzione calda fatta di tamponi, chelanti ionici e sapone per 1-2 ore (blocking o condizionamento)
6) aggiungi il tuo DNA radioattivo (probe) sempre a caldo e nello stesso tampone di prima
7) lavi più volte con soluzioni saline con saponi per togliere le sonde non attaccate al target
8) esponi il filtro con lastra e piastra di scintilligrafia a -80°C
9) sviluppi la lastra

Ovviamente la tua specificità sarà data da:
a) temperatura e tempo di incubazione
b) durata del lavaggio, temperatura e concentrazione di sapone
c) bontà del DNA genomico sul filtro
d) lunghezza e sequenza della sonda

allo stesso modo in cui si considera il protocollo per la PCR
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chica3



45 Messaggi
Inserito il - 14 giugno 2010 : 19:59:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pin  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Pin Invia a Pin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Proprio in questo momento rileggendo la mia domanda mi sono accorto di quanto essa sia stata stupida e di come vi abbia fatto perdere tempo.
Ovvio che le sonde possono legardi alla nitrocellulosa (sono di dna proprio come le molecole che io voglio analizzare).

Quindi da quanto leggo l'operazione di blocking va fatta prima di addizionare i probe marcati giusto?
Gli ingredienti per bloccare la nitrocellulosa ed evitare che i probe mi vadano a legare gli spazi tra le bande sono sapone+tamponi+agenti chelanti, giusto?

"Non è mai tardi per tentar l'ignoto. Non è mai tardi per andar oltre."

Gabriele D'Annunzio
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 15 giugno 2010 : 12:04:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1) prima, durante e dopo

2) in pratica sì
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