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valeriamassa
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
64 Messaggi |
 Inserito il - 11 gennaio 2007 : 13:37:10
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Ciao a tutti,mi è sorto un dubbio atroce: ho tagliato un vettore con ecor1, ho tagliato il mio inserto con ecor1 e ho defosforilato il mio vettore. Quando defosforilo quanti gruppi fosfato elimino? Ne elimino due per ogni molecola di vettore? E allora quando ligo l'inserto questo riporta i gruppi fosfato necessari? a me non tornano tanto i conti..
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valeria |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2007 : 19:16:15
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Sì, l'inserto fornisce i fosfati necesssari per ligare l'inserto al vettore a due estremità. Gli strand opposti rimarranno con due nicks che verranno riparati da E.Coli dopo la trasformazione
Ciao |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 11 gennaio 2007 : 21:50:49
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Non ti tornano i conti giustamente: infatti due nicks rimangono sempre
e comunque all'interno del plasmide ligato (prodotto finale) dopo una
defosforilazione delle sue estremità.
L'inserto porta sì due gruppi fosfato, ma questi vanno a legarsi
alle estremità 3' libere del plasmide, mentre quelle 5' -defosforilate-
rimangono tali anche nel prodotto finale: 2 su 4 legami fosfodiesterici
non avvengono, per questo rimangono 2 nicks(uno per filamento)
Quando lo feci notare ai miei tutors, ai tempi dei laboratori
didattici, questi ci rimasero di sasso, ammettendo che non ci
avevano mai pensato prima (e chissà quante ligazioni avevano
fatto senza saperlo ...). Cmq mi dissero che questa cosa non
è di impedimento alla cellula che incorporerà il plasmide,
perchè esistono meccanismi enzimatici adatti per far fronte
a questo tipo di problema (nucleotide chinasi, ad esempio). |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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valeriamassa
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
64 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2007 : 10:27:33
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Grazie davvero a tutti e due, mi avete confortato molto perchè pensavo di essere stupida anche solo a pormi il problema...Grazie ancora,
vale |
valeria |
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