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Dr Lopez
Utente Junior
141 Messaggi |
 Inserito il - 06 luglio 2012 : 18:40:48
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Ciao Ragazzi! Allora se io ho davanti a me una lastra elettroforetica e voglio cercare di capire dove stanno i frammetni più lunghi e dove quelli più brevi, devo guardare se le bande sono ben distanziate oppure no... Ovvero in alto troverò bande non ben differenziate, mentre in basso, dove sono presenti i frammenti più brevi troverò bande molto ben differenziate... Io però non riesco a capirne il motivo... Dovrebbe essere qualcosa legato alla differenza in percentuale tra i frammenti... C'è qualcuno che mi può aiutare??? grazie mille !
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2012 : 21:35:14
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Innanzitutto dato che i frammenti di DNA vengono separati in base alla loro mobilità relativa, che dipende a sua volta dalle dimensioni dei frammenti lineari, in un gel elettroforetico troverai i frammenti grandi in alto (verso il polo catodico) e quelli via via più corti in basso.
Credo tu ti riferisca alla distribuzione dei frammenti che ottieni usando un gel ad una data percentuale che permette una buona separazione dei frammenti a basso peso molecolare rispetto a quelli più grandi (cioè un gel piuttosto concentrato in %). In gel piuttosto concentrati infatti la trama reticolare del gel è talmente fitta da permettere una buona risoluzione dei frammenti piccoli che si differenziano anche di poche basi tra loro, ma al contempo il grandi frammenti non riescono a migrare fluentemente nel gel e si ammassano all'inizio in un'unica banda poco distinta.
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Dr Lopez
Utente Junior
141 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2012 : 22:24:00
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| Ti ringrazio molto Geeko per la risposta, ma non mi riferivo all'agarosio o alla poliacrilammide. Cioè, il professore aveva insistito sul fatto che frammenti della lunghezza di 1000, 950, 800, 750 nucleotidi non sono ben separati, ma formano quasi una banda unica... Motivo questo per il quale in genere il limite massimo di lunghezza di frammenti separati elettroforeticamente è di 1000 circa... I frammenti invece di 10, 20, 30, 50, 70 nucleotidi, sono molto ben separati tra di essi... Mi chiedevo per quale motivo... |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 00:13:33
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Io credo proprio che la ragione dell'osservazione che fai tu è sempre quella che ti ho scritto sopra, e dipende fondamentalmente dalle dimensioni dei "pori" del reticolo del gel.
Con pori di piccole dimensioni i frammenti più ingombranti non riescono a migrare realmente secondo la loro lunghezza e quindi l'insieme di questi frammenti più lunghi non verrà risolto e migreranno come un'unica banda. E' un po' come far passare uno squalo, un delfino e una tartaruga marina attraverso una rete da pesca con maglie strette a sufficienza da non far passare nessuno di questi tre animali, te li troverai comunque tutti e tre impigliati anche se possono avere dimensioni diverse l'uno dall'altro...
Comunque se qualcun'altro vuole intervenire, perché a me viene in mente solo questa spiegazione. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 05:03:51
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| Concordo appieno con quanto detto da Geeko. Non concordo però sui valori che tu dai per il limite di separazione: in elettroforesi su agarosio vedi molto bene una differenza tra 1000 e 800 bp, e la puoi vedere anche tra 1000 e 900 bp, giocando sulla concentrazione di agarosio e il tempo di corsa. Non penso proprio invece che tu possa distinguere frammenti di 10, 20, o 40 bp visto che sono talmente piccoli da non risentire molto dell'effetto "setaccio molecolare" del gel e quindi, a mio avviso correrebbero vicinissimi tra loro (anzi generalmente non li vedi nemmeno in un gel). |
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Dr Lopez
Utente Junior
141 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 17:08:04
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Carissimi Geeko e SpemannOrganizer, credo di essermi finalmente ricordato ciò che diceva il professore... Quello che intendevo dire è che, se mi trovo di fronte ad una lastra su cui per esempio è stato eseguito un sequenziamento, e mi viene chiesto di capire come devo leggere la lastra stessa, ovvero dove stanno i frammenti più lunghi e dove quelli più brevi, devo considerare la differenza percentuale di lunghezza tra i frammenti stessi. Ossia, tra un frammento di 10 ed uno di 11 nucleotidi, la differenza in percentuale sarà di 1/10, mentre tra un frammento di 1000 ed uno di 1001 nucleotidi, la differenza percentuale sarà molto minore, 1/1000. E' questa la ragione per la quale, pur essendo la differenza in nucleotidi sempre uguale, la differenza percentuale è molto diversa, e questo si riflette conseguentemente nella maggiore o minore vicinanza dei frammenti... Questo almeno è quello che mi sono appena ricordato ragionandoci un attimo, ma potrei sbagliare in pieno... Che ne pensate?? |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 17:21:08
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Sì quello che dici ha un senso, la differenza percentuale in nucleotidi cambia, ma non capisco come inserisci questo ragionamento per "risolvere" il problema che avevi.
Tra l'altro non ho ben capito di che problema o domanda si trattava..cioè ti viene chiesto semplicemente di dire a quale banda del gel corrisponde il frammento più lungo? O capire il motivo della disposizione delle bande?
Comunque tieni sempre presente che il potere risolutivo di un gel dipende dalla sua concentrazione (vedi dimensione dei pori del reticolo) in relazione alle dimensioni dei frammenti che intendi separare bene in bande distinte. |
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Dr Lopez
Utente Junior
141 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2012 : 17:36:26
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| Probabilmente avevo esposto male inizialmente il problema, comunque la domanda che il professore pone è semplicemente il motivo della disposizione delle bande... Ti ringrazio molto Geeko... Buona serata :) |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 07 luglio 2012 : 17:48:18
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Niente! Buona serata anche a te ;) |
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Discussione |
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Riconoscimento frammenti più lunghi e brevi in elettroforesi
Didattica
