Protocollo T4 DNA ligasi Takara

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Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2007 : 16:12:07

Carissimi..qualkuno utilizza la T4 DNA ligasi della Takara? In tal caso potreste darmi il protocollo relativo? Nello sheet del prodotto nn se ne fa menzione..tanto meno sul catalogo ke ho qui in laboratorio..fino ad ora ho lavorato con la T4 della fermentas ke agisce incubando 1h a 22�C e disattivando x 10 minuti a 65�C ma nn credo vada bene anke x l'enzima Takara.

Bacioni..e grazie.

Farah

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 17:10:33

Mah? Secondo me non ci dovrebbero essere differenze tra i protocolli di T4 DNA ligasi di diverse case.
Sul protoccollo della mia T4 DNA ligasi c'e scritto di utilizzarla:
1 h a 23-26�C per Cohesive Ends
16-24 h a 14�C per Blunt Ends

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 17:14:49

Grazie..ma secondo me dipende dalla marca..solitamente ci sono delle restrizioni di questo tipo.

Farah

AleXo
Moderatore

Prov.: Estero
Citt�: San Francisco, California

1550 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 23:24:18

io della takara usavo il ligation kit (provati sia il .1 che .2)... andavo sempre sul sicuro: 16� O/N.

(a volte, per sticky ends, scaldavo sui 60 il mix di DNA, poi raffreddavo in ghiaccio e aggiungevo la T4)

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2007 : 12:42:47

Io ho preso l'enzima ed il buffer...il kit in cosa consiste?

Farah

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2007 : 21:08:55

Inoltre...� possibile ke abbia un problemino di diluizione..cio� il mio enzima � 350U/microlitro..x una ligasi di solito si usano da 1 a 5 U in una reazione..ci� vorrebbe dire diluire di un casino di volte la mia ligasi...ma se invece lavorassi senza la diluizione..oltre ke (ovviamente) sprecare + enzima..cosa potrebbe accadere alla reazione?

Farah

DOCTOR G
Nuovo Arrivato

11 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2007 : 12:53:29

ti va in saturazione la reazione, ma sprechi solo l'enzima. Cmq il protocollo non dovrebbe variare da marca a marca. Prova solo a diluire, la concentrazione iniziale mi sembra eccessiva...

Marianna
Utente Junior

146 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2007 : 17:23:00

E se anke la reazione va a saturazione...mica vuol dire ke il frammento nn si inserisce? Perk� mil dubbio �...in cosa devo farla questa diluizione?

Farah

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