Il campione di PCR non migra nel gel

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Autore

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eimi
Nuovo Arrivato

Citt�: Modena

5 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2012 : 11:34:00

Ciao, sto tentando di amplificare un amplicone di 5000 bp. Finora, non sono riuscita a vedere la banda alla giusta altezza, ma solo a 3000 bp, tuttavia era gi� qualcosa. almeno vedevo una banda! Ora, cercando di ottimizzare la PCR, ho cambiato la Taq, la concentrazione del MgCl2....ecc...solo che ora ho un altro problema: i campioni di PCR non escono pi� dal pozzetto di caricamento, mentre il marker corre normalmente...
Il protocollo della pCR non l'ho modificato.
Il gel l'ho fatto allo 0,8% e poi anche allo 0,5%...pi� lasso di cos� non posso farlo!
Grazie per la vostra attenzione....spero mi sappiate dare una spiegazione...

Eltelin
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2012 : 17:19:40

il campo elettrico � corretto?

Lorydd
Nuovo Arrivato

17 Messaggi

Inserito il - 30 settembre 2012 : 12:54:20

Visto che con la prima PCR hai avuto un risultato..non � che hai disegnato male i primer e in realt� stai amplificando un frammento da 3000? hai provato ad inserirli su genome browser?

eimi
Nuovo Arrivato

Citt�: Modena

5 Messaggi

Inserito il - 06 ottobre 2012 : 19:30:23

@ Eltelin: sono sicura che il campo elettrico sia corretto perch� il marker � migrato correttamente.
@Lorydd: i primers li ho controllati ma ci riprover� nuovamente. Sto quasi pensando di disegnarne dei nuovi...
grazie a entrambe.

zerhos
Utente Junior

Prov.: Pisa
Citt�: Pisa

421 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2012 : 16:20:26

Che stampo usi? Genomico, plasmide, cDNA?
Se fosse cDNA, � di un particolare tessuto? potrebbe essere un'isoforma della tua sequenza.

Inoltre la banda � pulita a 3kb o vedi dello smear? se vedi lo smear � possibile che dai troppo poco tempo di elongation. Che taq usi?

"l'unica differenza tra me e un pazzo � che io non sono pazzo!"
Salvador.Dal�