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RGB
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11 Messaggi
Inserito il - 20 aprile 2015 : 08:43:38  Mostra Profilo Invia a RGB un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno a tutti, ho un quesito da porvi. Devo fare una RIP (RNA-immunoprecipitation), sono riuscita a settare i parametri in merito alla quantità di estratto proteico e anticorpo da utilizzare ma da settimane ormai, ottengo solo RNA degradato. Qualcuno mi può dare un suggerimento/ un trucco in più per evitare la degradazione? Grazie

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1724 Messaggi
Inserito il - 20 aprile 2015 : 23:15:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quanta esperienza hai con l'RNA? C'è poco da fare: hai qualcosa contaminato da RNasi, devi scoprire cos'è e eliminarlo. Usi i guanti? Come estrai l'RNA? Trizol? Prepara le soluzioni di EtOH, Isop., e acqua nuove. Usi le punte con filtro? Come sai che è degradato? Lo corri su gel? Hai lavato il lettino con NaOH?
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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RGB
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2015 : 16:44:38  Mostra Profilo Invia a RGB un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per aver risposto. Faccio tutto con i guanti e sotto cappa. Uso il trisure che è simile al trizol e preparo tutte le soluzione col l'acqua DEPC. oltre a correrlo su gel e vedere il classico smear di degradazione leggo al biofotometro e il rapporto 260/230 è sempre molto basso.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1724 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2015 : 17:00:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok. Il rapporto 260/230 non è indice di degradazione, ma del fatto che ci siano delle contaminanti fenoliche che ti porti dietro dall'estrazione.
http://en.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_quantitation#Spectrophotometric_analysis
Quindi secondo me c'è qualcosa che non va durante l'estrazione. Purtroppo non ti so dire cosa. Potresti provare a estrarre l'Rna tot da cellule e vedere se hai lo stesso problema (giusto per capire se è la soluzione di trisure ad avere qualcosa che non va)
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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