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ohsorbole
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: Bologna
15 Messaggi |
 Inserito il - 19 settembre 2007 : 12:04:56
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Ciao.
Nel laboratorio in cui lavoro c'è una paranoia pazzesca tiguardo la TAQ polimerasi. Si dice che non deve assolutamente stare più di qualche secondo fuori dal freezer. Dopo averla messa nella soluzione per la PCR, bisogna fare tutto ultravelocemente altrimenti la TAQ si degrada.
Sì, però poi si schiaffa nel termociclatore a 94 gradi per 5 minuti (più tutti gli altri cicli). Se non si degrada a 94 gradi, perché dovrebbe farlo se sta a 25 gradi per qualche minuto?
Grazie
Bye.
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Isabellaaaa
Nuovo Arrivato
Città: Salerno
13 Messaggi |
 Inserito il - 19 settembre 2007 : 12:24:00
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Ciao ohsorbole anche nel mio lab è così figurati che io lavoro in ghiaccio quando devo usare la taq.. E' vero si degrada!! Credo che nel termociclatore associata agli altri elementi faccia il suo dovere... Misteri della biologia molecolare!!  |
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i_bio
Nuovo Arrivato
Città: bari
85 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 12:28:08
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La Taq è termostabile e siccome è stata ottenuta da un batterio termofilo che si è adattato a vivere nelle solfatare (quindi ad alte temperature),lavora a 70°C e resta attivo anche a t° + alte, se tu la lasci alle temperature ambienti nn ti funziona +! |
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ohsorbole
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: Bologna
15 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 12:44:34
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Per i_bio: è proprio quello che non capisco.
Questa molecola non si scassa a -20°, funziona senza scassarsi da 70° in poi, ma si scassa a temperatura ambiente. Perché mai? Se la temperatura a cui normalmente si trova è 70°, non dovrebbe scassarsi anche a -20°? |
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i_bio
Nuovo Arrivato
Città: bari
85 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 14:45:02
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| Non vorrei dire una fesseria...quello che mi ricordo di quando ho usato questa Dna Pol è che a -20 praticamente è come se congelassi la sua struttura x cui è vero che nn funziona ma è anche vero che nn si denatura x cui la puoi conservare...spero d ricordar bene! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 15:10:09
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A parte il fatto che alla fine di una PCR l'attività della Taq è minore dell'inizio, credo il problema sia che se tu lasci la tua provetta con la Taq a temperatura ambiente questa comincerà lentamente a perdere attività.
Poi tu ne metti un microlitro o due nella tua mix e rimetti il tutto in freezer dove la proteina molto probabilmente non si rinaturerà.
Ogni volta che fai questo perdi un po' di attività e quindi a lungo termine l'enzima non funzionerà più.
Tra l'altro la presenza di DNA durante la PCR stabilizza la Taq diminuendone la denaturazione.
Se vuoi approfondire l'argomento vedi:
Comparative thermal denaturation of Thermus aquaticus and Escherichia coli type 1 DNA polymerases
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i_bio
Nuovo Arrivato
Città: bari
85 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 15:30:33
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| Tutto vero...il dubbio sta nel fatto che visto che la Taq perde attività a t°ambiente cm mai a -20° invece no? |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 16:24:07
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Allora...vediamo se mi ricordo bene tutto perchè oggi sono particolarmente lessa...
Citazione:
Questa molecola non si scassa a -20°
innanzitutto la taq a -20°C non si scassa perchè è criopreservata, se guardi bene quando la prelevi è una soluzione viscosa dentro, questo perchè, oltre al buffer in cui la proteina è stata eluita durante la purificazione, c'è pure del glicerolo...infatti non si ghiaccia nemmeno ...
Citazione:
però poi si schiaffa nel termociclatore a 94 gradi per 5 minuti
la maggior parte della Taq in commercio sono hot start, il che significa che necessitano calore per essere attivate...in particolare la maggior parte delle Taq sono legate da un anticorpo che si stacca nella fase iniziale del ciclo di pcr, cioè nei 5 minuti iniziali a 95°C (94°C-96°C alcune vanno anche a queste temperature)
Citazione:
anche nel mio lab è così figurati che io lavoro in ghiaccio quando devo usare la taq
lavorare in ghiaccio non è una follia è un buon modo di lavorare con un enzima (la stessa regola vale anche quando si utilizzano gli enzimi di restrizione), cmq una residua attività l'enzima ce l'ha pure a temperatura ambiente e rischi che amplifichi anche alcuni aspecifici...
io spesso lavoro con una Taq non hot start molto molto particolare e lì è veramente superparanoia, non solo lavoro sempre e solo in ghiaccio (ma la taq me la tengo nella vaschetta col ghiaccio per tutto il tempo in cui preparo la mix della pcr) ma carico le provette sul termociclatore solo quando arriva attorno ai 90°C... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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i_bio
Nuovo Arrivato
Città: bari
85 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 16:34:22
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| Grazie dei chiarimenti biochica!...ricordavo bene |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 16:58:04
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Figurati! Nessun problema!!!
Giusto per puntualizzare ho scritto che con la taq non hot start che uso il lavoro è pura paranoia...ma non intendevo che sono una maniaca, semplicemente metto un po' più attenzione a quello che faccio...ma con questa Taq sono riuscita a fare pcr da 56 campioni...e quindi il tempo di aliquotare la mix e mettere il DNA non è esattamente 30 secondi...
lavorare BENE significa sapere cosa si sta facendo in ogni passaggio e perchè lo si sta facendo...se metti la taq di corsa nella mix rischi di inquinare taq e mix...se non mescoli bene per paura che la taq si incenerisca al minimo contatto con la temperatura ambiente e non la spinni rischi di non avere risultato...se aliquoti la mix alla velocità della luce e ci sbatti dentro il DNA rischi di inquinare perchè non ci hai prestato attenzione |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 17:37:42
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Io penso che la Taq hot start sia stata creata per evitare di lavorare in ghiaccio.
Mi spiego meglio.
Lavoriamo in ghiaccio per bloccare l'enzima Taq e per evitare l'appaiamento di alcuni primers.
Se lavorassimo a T° ambiente alcuni primer potrebbero attaccarsi e in questo caso la Taq polimerasi lavorerebbe lo stesso, piano ma lo farebbe. Questo ci sballerebbe tutti i nostri piani!
La Taq hot start,secondo me, presenta un anticorpo nel sito funzionale che non le permette di lavorare, a 90 e passa gradi questo si denatura e dando il via libera alla Taq.
Può essere?
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Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 18:16:07
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Io faccio all'incirca 500 genotipizzazioni al mese (mediamente) mediante PCR (taq eppendorf)
a cui vanno aggiunte le PCR di biologia molecolare etc etc...
non ho mai usato il ghiaccio per la preparazione, anzi... a dire il vero all'inizio lo facevo poi ho smesso quando si ruppe la macchina del ghiaccio... ho visto che il risultato era identico e da allora in poi tutte le PCR le ho fatto senza ghiaccio... ed anche l'enzima taq lo prendo senza ghiaccio.
Inutile dire che le PCR mi escono (in genere) ed anche bene.
La grossa differenza che ho notato sta nei primers... una volta scongelati e ricongelati 4-5 volte sono praticamente da buttare, l'efficienza cala quasi improvvisamente, per cui li conservo le aliquote in uso direttamente a 4°C in TE... Idem per i nucleotidi, ma meglio conservarli a -20°C in modo tale da non scongelarli più di 4-5 volte.
La taq lasciata anche o.n. a temperatura ambiente conserva una buona quota di attività il giorno dopo (letto dal manuale della casa)... nel vostro caso se contate quanti secondi resta fuori dal ghiaccio... e poi mentre si riscalda etc etc... secondo me è una di quelle cose che si tramandano per evitare il calo dell'attenzione dell'operatore... provare per credere.
P.S.: piccolo trucco da provare... non mettete i tubini di PCR nella macchina quando fate partire la PCR... aspettate che la temperatura salga a 94-95°C, premete pausa e poi aggiungete i tubini direttamente... lo shock termico aiuterà un sacco il prodotto finale di PCR... 
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questo è valido per la Taq standard senza l'attività esonucleasica
Diverso è il caso di altri enzimi, come la Pfu, l'expand, l'High fidelity etc etc...
questi enzimi possono (e vi assicuro che lo fanno!) degradare il DNA templato o i primers mentre dispensate la MIX ed i DNA templati
in questi casi è ASSOLUTAMENTE necessario preparare tutto in ghiaccio ed aggiungere l'enzima solo quando la mix si è raffreddata in ghiaccio... per fare più veloce in genere preparo la mix e la lascio in ghiaccio a raffreddare mentre preparo le eppendorf per le PCR, solo dopo aggiungo l'enzima e la faccio partire HOT start appena dopo.
Ovviamente le eppendorf si trovano in ghiaccio o coolers appositi fino all'ultimo istante fino a metterli direttamente a 94-95°C... altrimenti il prodotto di PCR ne soffre tantissimo.
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Mi spiegate questa cosa sulla TAQ?
Didattica
