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kiki
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 Inserito il - 08 novembre 2007 : 23:04:40
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ciao a tutti!per caso sapete cos'è l'adattatore quando si parla di geni inseriti in vettori?ho trovato in un articolo che in un gene precedentemente inserito in un vettore è stato inserito un adattatore contenente dei siti di di taglio per enzimi di restrizione..grazie a questo poi si è potuto inserire un amplificato.
Altra curiosità: in genere x inserire un gene in un vettore si taglia in dna con gli stessi enzimi di restrizione con cui si taglia in vettore; ho trovato xrò che il gene da inserire può essere ottenuto anche mediante pcr e poi inserito in un vettore, in questo modo come si fa ad ottenere estremità coesive che poi vengono ligate?
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Balsamo del Canadà
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Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 11:01:46
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Ciao Kiki. Quelli che citi sono due sistemi per far avere al tuo inserto delle estremità sticky della tipologia che vuoi tu.
Gli adattatori sono proprio dei brevi frammenti che "trasformano" le tue estremità in quelle di un sito a tuo piacere. Semplicemente vengono legate alle tue estremità e contengono esse stesse un consenso per un altro enzima di restrizione. Più o meno allo stesso modo funzionano i LINKER.
Per quanto riguarda la PCR ci si riferisce alla possibilità di usare primer un pò più lunghi del solito che si appaino alle nostre estremità del futuro amplificato tramite la zona in 3'. Ma in più hanno in 5' una porzione che non si appaia alla molecola da amplificare ma che contiene il consenso di un enzima di restrizione.
Quando polimerizzi, si inserirà ,alla fine del nuovo filamento, la nuova porzione di sequenza. Così dal secondo ciclo avrai solo molecole allungate con il sito che desisderi tu. Quando purifichi puoi tagliare e avrai le tue sticky.
Inoltre è davvero comodo perchè puoi usare due siti diversi tra i due primer e ottenere dei clonaggi direzionali se per caso devi clonare cDNA o altro in vettori di espressione! |
-B.del C.- |
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kiki
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97 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 11:59:46
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Grazie mille!!quindi risulta più vantaggioso ottenere la porzione di DNA che mi interessa mediante PCR rispetto all'uso di enzimi di restrizione?
Altro dubbio: in un altro articolo ho trovato che per verificare se il gene si è inserito correttamente nel vettore hanno trasformato cellule batteriche. Poi hanno estratto il vettore e hanno trasfettato cellule eucariotiche per far esprimere RNA: ma non si poteva evitare il passaggio della trasformazione in cell batteriche e passare subito alla trasfezione controllando poi se le cell trasfettate avessero assunto vettore con l'inserto?
L'RNA non poteva essere espresso anche in nelle cell batteriche?
Grazie miLLe!! |
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maia84
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43 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 12:29:50
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| Se hai a che fare con un vettore di espressione è necessario un apparato di traduzione tipicamente eucariotico che è abbastanza diverso rispetto a quello di una cellula procariotica...Di solito vengono usate le cellule batteriche perchè puoi verificare in modo molto piu' semplice e in tempi ridotti la funzionalità del vettore. Questi vettori vengono chiamati anche "shuttle" perchè possono essere trasferiti da una cellula procariotica ad una eucariotica, infatti presentano entrambe le origini di replicazione. |
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Balsamo del Canadà
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Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 13:39:08
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Citazione:
Messaggio inserito da kiki
Grazie mille!!quindi risulta più vantaggioso ottenere la porzione di DNA che mi interessa mediante PCR rispetto all'uso di enzimi di restrizione?
Altro dubbio: in un altro articolo ho trovato che per verificare se il gene si è inserito correttamente nel vettore hanno trasformato cellule batteriche. Poi hanno estratto il vettore e hanno trasfettato cellule eucariotiche per far esprimere RNA: ma non si poteva evitare il passaggio della trasformazione in cell batteriche e passare subito alla trasfezione controllando poi se le cell trasfettate avessero assunto vettore con l'inserto?
L'RNA non poteva essere espresso anche in nelle cell batteriche?
Grazie miLLe!!
Beh, cosa è più vantaggioso dipende da moltissimi fattori. Se hai le estremità giuste meglio così. La PCR ti offre una soluzione in più! Comunque molte volte si sceglie in base alle disponibilità finanziarie! Far sintetizzare dei primer nuovi apposta per ogni clonaggio è dispendioso!
Per il secondo dubbio non saprei, io penso che abbiano usato il passaggio in batterio per amplificare il loro vettore in modo da averne quantità sufficienti. Dire così come mai abbiano preferito passare ad ospite è difficile, dovrei leggere l'articolo e vedere cosa stanno tentando di fare. alla fine la produzione di RNA è possibile anche in batterio. Basta avere un promotore per una RNApolimerasi fagica ed aggiungerla. Questo passaggio probabilmente era un ulteriore controllo all'avvenuta inserzione. Di solito si usa come prima prova il clonaggio inserzionale. Cioè il sito di policlonaggio cade tipo in LacZ inattivandolo, quindi fanno uno screening bianco/blu sul terreno con Xgal e IPTG.
Però può accadere che per sfortuna la clonazione avvenga in frame o che comunque il frammento di LacZ rimanga attivo. Quindi si preferisce fare un secondo controllo.
Ma il perchè siano passati ad eucarioti non te lo so dire. Forse il vettore era di espressione per quell'ospite quindi era l'unico modo per verificare la produzione di RNA dell'inserto! |
-B.del C.- |
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Eleo
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Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 17:18:13
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| in caso di gene ottenuto attraverso PCR non bisogna dimenticare che si può fare anche clonaggio senza passare attraverso il taglio del prodotto in modo da produrre estremità coesive, ma si può fare ligazione anche di blunt-end, che però è senza dubbio una strategia molto meno efficiente delle più comuni strategie di clonaggio.In questo caso ad esempio taglio il vettore con l'enzima o gli enzimi che mi interessano, faccio il fill-in, cioè il riempimento delle estremità coesive che si sono generate, usando in genere la polimerasi Klenow o quella di T4, defosforilo le estremità del vettore in modo che non possa richiudersi su se stesso senza inserto durante la ligazione infine nella miscela di ligazione metto il vettore, il mio inserto e la ligasi. In questo caso però è necessario far produrre dei primers con l'estremità fosforilata o usare kit per fosforilarli. Se non uso oligo fosforilati non devo dafosforilare il vettore...dipende dai casi. Entrambe le scelte hanno svantaggi: se non defosforilo il vettore rischio che si richiuda semplicemente su se stesso, se invece uso oligo fosforilati rischio di avere nel vettore più copie dell'inserto (un treno di prodotti di PCR ligati fra loro e poi ligati nel vettore...) |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2007 : 17:33:17
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altra cosa...in caso di gene ottenuto come prodotto di PCR se si può è possibile anche disegnare i primers contenenti il o i siti di restrizione di interesse compatibili con le estremità generate dagli enzimi usati per il taglio del vettore a questo punto è semplicissimo, taglio il vettore, faccio la PCR, taglio il prodotto di PCR e poi mi comporto come se avessi il gene prodotto mediante restrizione!!!
All'altro tuo dubbio quello che posso dire è:
dopo aver clonato il gene nel vettore di interesse, trasformo cellule batteriche, poi lo estraggo dai miei batteri (ne ho prodotto in questo modo tanto) e posso controllare mediante analisi di restrizione se è tutto ok cioè se c'è l'inserto, se è nel posto giusto, ecc...o fare anche altro.
Probabilmente è banale quello che ti ho detto, ma ricorda che per fare la ligazione uso poco DNA e non ho modo di controllare se è avvenuta correttamente o no se non trasformo i batteri.
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