| Autore |
Discussione |
|
|
Crystal85
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 15 luglio 2008 : 21:53:15
|
salve a tutti.
A breve comincerò il mio tirocinio che si baserà principalmente sulla tecnica dell'immunoistochimica. So che è abbastanza semplice e metodica ma vorrei sapere se qualcuno di voi ha gia qualche protocollo standard che posso iniziare a guardare per farmi un'idea e non arrivare completamente digiuno.
vi ringrazio anticipatamente 
|
|
|
|
|
la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 17 luglio 2008 : 22:07:59
|
ciao ti scrivo la metodica di immuno per immunoperossidasi che è quella che uso
PROTOCOLLO PER SEZIONI INCLUSE IN PARAFFINA
1°GIORNO
Sulle sezioni paraffinate è necessario effettuare prima del trattamento immunoenzimatico lo smascheramento antigenico allo scopo di smascherare epitopi e recuperare l'antigenicità persa a causa della fissazione con formalina
- sparaffinare in xilolo (2 cambi da 8' ciascuno)
- etanolo assoluto (3 passaggi veloci)
- etanolo 96° (2 passaggi veloci)
- H2O distillata (3-4 passaggi veloci)
- smascheramento antigenico (dividere le vaschette a seconda del trattamento):
> AUTOCLAVE: porre i vetri in tampone citrato 5mM pH 6.8, in alternativa si può usare anche EDTA soluzione pH 8. Mettere i vetri in autoclave a 95°C per 6'; a tempo scaduto, spegnere l'autoclave e aspettare 10' prima di aprirla; successivamente lasciare le vaschette sotto cappa per 30' senza togliere il tampone(in modo tale che i vetri raggiungano RT in modo graduale)
> TRIPSINA: porre i vetri per 5' in TBS a 37°C precedentemente scaldato, poi trasferire i vetri nella vaschetta con tripsina per 20' (sempre in stufa a 37°C) poi rimettere i vetri in TBS caldo togliendoli dalla stufa e buttare la tripsina usata
- porre u vetri in PBS per 10' poi in PBS+Triton (3 passaggi da 5' ciascuno)
- incubare i vetri con siero di goat 1:50 per 30' (se l'Ab primario è mouse o rabbit, mentre se devo testare un anticorpo di goat uso albumina umana)
- incubare con anticorpo primario overnight a 4°C
2° GIORNO
- lasciare i vetri a RT per 30'-45'
- 3 lavaggi di 5' ciascuno con PBS+T
- incubare con Ab secondario biotinilato a RT per 30' con diluizione adeguata a seconda della specie utilizzata (rabbit 1:200, mouse e goat 1:100)
- fare 3 lavaggi da 5' con PBS+T
- incubare per 30' i vetri con streptavidina perossidata 1:300, diluita al momento in PBS
- fare 3 lavaggi da 5' ciascuno in PBS senza Triton
- SVILUPPO: in 3,3'-diaminobenzidine (DAB) in pastiglie (1pastiglia di DAB e 1 di urea per 15ml di H2O distillata),agitare la soluzione fino a completo scioglimento e versare nella/e vaschetta/e, lasciando agire 6' al buio
- scaduto il tempo versare la soluzione nel bidone degli scarti facendo attenzione a non sporcarsi e usando sempre i guanti (la DAB è carcinogena), sciacquare i vetri con H2O distillata e buttare anche il risciacquo nel bidone, lasciare poi la vaschetta con i vetri sotto l'acqua corrente per almeno 5'
- controcolorare con emallume di Mayer secondo i tempi stabiliti volta per volta (secondo la vecchiaia del colorante)
- sciacquare in acqua corrente
- procedere con la disidratazione in scala di alcoli crescente (l'inverso della prima parte) e procedere al montaggio |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
 |
|
|
Crystal85
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 18 luglio 2008 : 12:14:30
|
grazie mille la-Fra , sei stata gentilissima 
io mi occuperò di sezioni di cervelletto e dovrò completare un lavoro che avevo iniziato facendo HPLC. |
|
|
|
giuseppe sberla
Nuovo Arrivato
Prov.: SICILIA
Città: SIRACUSA
43 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2010 : 17:39:53
|
| ciao , la -fra ti volevo chiedere ma non usi l'H2O2 per inattivare l'attività endogena della perossidasi ? |
|
|
|
nella988
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2011 : 15:24:08
|
| Ciao!!!sapete dove posso trovare immagini,disegni carini sulla tecnica dell'immunoistochimica(i vari passaggi)???grazieeee |
|
|
| |
Discussione |
|
Immunoistochimica
Didattica e Relazioni
