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w_hite
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22 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2011 : 20:20:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di w_hite Invia a w_hite un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve...potreste gentilmente aiutarmi a capire i vari passaggi?Per ora sono ineterssata a capire l'aspetto teorico di questo protocollo.
Allora i primi passaggi sono chiari mentre trovo difficoltà in seguito.Praticamente l'esperimento consiste nella:
- DISSEZIONE di larve
-FISSAGGIO in PBS + parafolmaldeide
-SCIACQUI per tre volte in PBT dove ho capito che la presenza del triton è fondamentale per la formazione di pori in modo da far entrare l'anticotpo
-infatti effettuata la permeabilizzazione poi si effettua l'INCUBAZIONE con l'anticorpo primario
e fin qui è tutto chiaro,ora ho nuovamente:
- 3 sciacqui in PBT
-incubazione con anticorpo secondario 1:400(goat anti mouse) in PBT (cosa vuol dire?)
-sciaqui in PBT
-Incubate in ABC reagents in PBT (1:400 A + 1:400 B) per 1 ora (potreste spiegarmi anche questo passaggio ? )
-3 sciacqui in PBT
-risciacqui in PBS 3 x 5'
-develop in PBS containing 0.5 m/ml DAB + una minima percentuale di H2O2 (anche qui avrei bisogno di una spiegazione)
-Stop con PBS
-Put in 20% glycerol in PBS

Spero possiate aiutarmi...grazie!

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2011 : 22:23:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un'anticorpo secondario goat anti-mouse è un anticorpo prodotto in capra (goat) che riconosce IgG di topo (mouse). Quindi è un anticorpo anti-anticorpi di topo. E' "secondario" semplicemente perchè si attacca al primo anticorpo che hai messo (primario) contro l'antigene di interesse. Nota che usi questo secondario se hai usato un primario prodotto in topo (es. mouse anti-X, dove X è la proteina di interesse), se il primario fosse prodotto in coniglio useresti, ad es, un goat anti-rabbit (la specie in cui hai prodotto il secondario non è importante, potresti usare anche un chicken anti-rabbit).

Gli anticorpi secondari spesso sono coniugati a molecole che servono per la detezione, ad es. fluorofori o, in questo caso, visto che usi il sistema ABC, alla biotina.

Citazione:
Incubate in ABC reagents in PBT (1:400 A + 1:400 B) per 1 ora

ABC è un sistema proprietario di Vector Labs che è basato su un sistema biotina-avidina. Puoi leggere spiegazioni più dettagliate sul loro sito, in sostanza aggiungi dell'avidina che va a legare la biotina coniugata al tuo secondario. Il kit contiene anche della perossidasi coniugata alla biotina, che può quindi legare l'avidina (ogni molecola di avidina può legare fino a 4 molecole di biotina).

La diaminobenzidina (DAB, http://en.wikipedia.org/wiki/3,3%27-Diaminobenzidine ) è un composto che può reagire con i radicali formati da perossidasi+H2O2 formando un composto colorato (marrone) che ti permette di vedere dove si è legato l'anticorpo.

Schemino (da sols.asu.edu)

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w_hite
Nuovo Arrivato



22 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 10:36:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di w_hite Invia a w_hite un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille,ora è tutto più chiaro...avrei però ancora dei dubbi...

-1:400 A + 1:400 B sta ad indicare le diluizioni vero?

-e dopo che con il DAB ho osservato dove si lega l'anticorpo,l'ultimo passaggio:put in 20% glycerol in PBS a cosa serve?
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 11:42:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Confermo che 1:4000 si tratta di diluizioni.

Per quanto riguarda il glicerolo, conoscendo il suo ruolo di crioprotettore e a quelle concentrazioni, suppongo venga addizionato per permettere il congelamento a basse temperature del tuo preparato.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 16:57:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
uhmmmm non so, penso che il passaggio finale in pbs glicerolo sia piu' per la montatura finale, quando si mette il vetrino coprioggetti sul campione. Perlomeno è quello che facevo io con i testicoli di Drosophila ed ora con le fettine di retina di Xenopus (ma usavo e uso glicerolo puro)

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 17:28:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Yup, il glicerolo può essere semplicemente usato come liquido di montaggio (invece di mettere ad es. il Moviol).

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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 17:41:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

uhmmmm non so, penso che il passaggio finale in pbs glicerolo sia piu' per la montatura finale, quando si mette il vetrino coprioggetti sul campione. Perlomeno è quello che facevo io con i testicoli di Drosophila ed ora con le fettine di retina di Xenopus (ma usavo e uso glicerolo puro)



TESTICOLI DI DROSOPHILA?

Arghhhhhh!



Mai fatto microscopia, pardon per la dritta sbagliata.
Magari da Gennaio con un bel po' di ore passate al confocale del Lab mi de-niubbizzerò.

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 17:48:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1

Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

uhmmmm non so, penso che il passaggio finale in pbs glicerolo sia piu' per la montatura finale, quando si mette il vetrino coprioggetti sul campione. Perlomeno è quello che facevo io con i testicoli di Drosophila ed ora con le fettine di retina di Xenopus (ma usavo e uso glicerolo puro)



TESTICOLI DI DROSOPHILA?

Arghhhhhh!



Mai fatto microscopia, pardon per la dritta sbagliata.
Magari da Gennaio con un bel po' di ore passate al confocale del Lab mi de-niubbizzerò.




Don't worry, in realtà usavo anche il glicerolo 5%/PBS come crioprotettivo, nel caso in cui dovessi fare squash di testicoli di drosophila (eh sì ero un detesticolatore di moscerini) :)

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 19:59:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vabbè ho fatto di peggio...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 20:25:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mmm... non vogliamo sapere!
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