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Rsr
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Inserito il - 23 gennaio 2013 : 18:52:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Rsr Invia a Rsr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve gente,

qualcuno riuscirebbe a spiegarmi il concetto della GFP fotoattivabile:
come si ottengono e il vantaggio del loro utilizzo!??

non ci salto fuori. Grazie a chiunque risponda!!

0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2013 : 19:11:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Leggendo in giro:

Fluorescent proteins, fused to a protein of interest, allow the
study of proteins and cellular processes in living cells, tissues and
even complete organisms. Ever since the discovery and cloning
of the first fluorescent protein (green fluorescent protein - GFP),
researchers have attempted to improve the properties of these
useful proteins. Directed evolution has removed unwanted
oligomerisation, improved quantum yields and photostability,
and has produced several sub-species with shifted spectra.
To study the dynamics of protein or cell movement it is
necessary to selectively discriminate a sub-population of protein
molecules or cells. One approach is to bleach a subpopulation of
labelled molecules and to record the redistribution of
unbleached molecules in the bleached area over time by a
technique called Fluorescent Recovery After Photobleaching
(FRAP). The selective activation of a subpopulation of proteins
however, allows more flexible experimental design.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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GFPina
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GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 24 gennaio 2013 : 23:59:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eheh non potevo non rispondere a questa discussione!

Comunque questo è molto interessante e spiega molte cose: http://jcs.biologists.org/content/120/24/4247.full

P.S. è un po' diverso dal photobleaching
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 01:49:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh, praticamente sono due facce della stessa medaglia, che sarebbe quella di osservare fenomeni cellulari e subcellulari in fieri.

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GFPina
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GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 25 gennaio 2013 : 10:03:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1

beh, praticamente sono due facce della stessa medaglia...

beh diciamo che sono due facce dello stesso dado, visto che le possibilità sono più di due!

Comunque sì, quello che intendevo è che sono "un po'" diverse perché il meccanismo è diverso, nel caso della FRAP tu con un fascio di luce fai "sparire" il segnale della fluorescenza e poi vai a vedere dove ricompare (ad es. puoi seguire lo spostamento di proteine fluorescenti che si spostano nella zona che hai "sbiancato"), mentre con la fotoattivazione tu hai le proteine che non emettono fluorescenza e con un fascio di luce le "attivi" ed iniziano ad emettere fluorescenza. Ovvio che le applicazioni poi possono essere diverse.



P.S. 0barra1 quando hai un po' di tempo ti consiglio di leggere il paper che ho linkato, è molto in interessante e fa un bel riassunto dei vari tipi di proteine fluorescenti disponibili.
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 13:01:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse mi sono espresso male o con una metafora erronea:

intendevo che sono

- facce, perché tecniche concettualmente opposte, una si basa sulla distruzione di una molecola fluorescente, l'altra sulla sua attivazione,

- della stessa moneta, ossia l'esame di eventi cellulari e subcellulari dinamici.

L'osservazione sul dado mi ha lasciato un po' perplesso invece, non vedo quali siano le altre facce, tranne che tu non intendessi l'esistenza di altre tecniche indipendenti dall'uso della fluorescenza per osservare fenomeni in fieri. Comunque l'articolo ero già intenzionato a leggerlo, mi incuriosiva molto, grazie a te che hai trovato un paper più "didattico" di quello che mi è capitato tra le mani.


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 14:37:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1

L'osservazione sul dado mi ha lasciato un po' perplesso invece, non vedo quali siano le altre facce, tranne che tu non intendessi l'esistenza di altre tecniche indipendenti dall'uso della fluorescenza per osservare fenomeni in fieri.


Io intendevo il fatto che ci sono varie proteine fluorescenti e vari "modi" di utilizzarle.
A parte i vari colori, hai proteine che quando vengono prodotte sono fluorescenti (GFP wt ad es.), proteine fluorescenti fotoattivabili (le attivi con la luce), proteine fluorescenti fotoconvertibili (cambiano colore dopo che le hai irradiate)...

Mi sa che intendevamo proprio due concetti diversi.

Va beh comunque, senza stare a discutere su medaglie e dadi (anche perché sinceramente non ho molto tempo) ti rimando semplicemente al paper.

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Rsr
Nuovo Arrivato


Città: Modena


15 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 16:47:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Rsr Invia a Rsr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok ragazzi,

riepilogando. Leggendo vari articoli quel che ho capito è che nello stato non eccitato la GFPwt è presente in due conformazioni, neutra e anionica con un rapporto, rispettivamente di 6:1. Lo stato basale viene stabilizzato a causa della presenza del glutammato 222, che per interazione elettrostatica repulsiva con un fenolato sfavorisce la forma anionica. Il fatto che circa il 15% della proteina sia in stato anionico crea dei problemi perchè quando irradio con gli UV c'è un emissione basale di fluorescenza a 475 nm (emissione della GFP wt in stato anionico), il che determina un contrasto ridotto.

Per risolvere questo problema (e per avere anche applicazioni peculiari in altri campi), è stata introdotta la mutazione T203H la quale stabilizza la forma basale della GFP. Dopo irradiazione intensa con raggi UV, il glutammato 222 va incontro a decarbossillazione (reazione irreversibile) con lo stabilizzarsi della forma anionica (perchè viene a mancare la repulsione elettrostatica). Elimino in questo modo il background di fondo.

Dico bene oppure ho capito male??

Grazie a tutti comunque.
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