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 L'arte della ligazione: chi è l'inserto, chi il vettore
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm
Citt: Paris, VIIme arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2013 : 14:23:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,

mi trovo giusto in questi giorni impegolato in una ligazione forse un po' particolare, almeno ai miei occhi di principiante.
Orbene, la teoria della ligazione ci insegna che per una buona ligazione è necessario mantenere un rapporto teorico tra inserto e vettore pari a 3:1. Nel mio caso specifico, tuttavia, il confine "ontologico" tra l'uno e l'altro è qualcosa di piuttosto sfumato: mentre ho svolto con successo svariate ligazioni tra plasmidi e frammenti di restrizione o prodotti di PCR in cui la differenza di dimensioni era proporzionalmente significativa, i due attori questa volta in questione si ritrovano a differire di appena 900 bp, ossia ho un inserto di 3,3 kbp e un umile pGST parallel 2 che si assesta attorno ai 4,2 kbp.
Ora, poiché il mio primo tentativo di trasformazione con la reazione di ligazione (su DH5alpha, shock termico) ha riscosso un successo pari a zero, mi chiedevo se in una situazione perlomeno ambigua tale rapporto andrebbe rivisto.
Aggiungo che il volume di DNA a mia disposizione è limitata, ergo la realizzazione di troppi tentativi con rapporti a scalare mi è quasi preclusa.

A voi la palla, e la mia riconoscenza, miei prodi bricoleur genetici.


So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

domi84
Moderatore

Smile3D

Citt: Glasgow


1682 Messaggi

Inserito il - 07 febbraio 2013 : 19:30:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Da quello che leggo qui (scaricando il data sheet) https://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/index.jsp?id=iforu&&catalogNumber=10481220001&iforu_page=search
Il rapporto molare 3:1 va mantenuto quando il vettore e inserto sono uguali in lunghezza......
Personalmente quando ligasi non venivano facevo scale con rapporti a scalare...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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