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SpemannOrganizer
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Spemann

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Inserito il - 01 marzo 2011 : 19:43:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
no io intendo il rapporto molare e ho sempre fatto così

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Subbenga
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Inserito il - 02 marzo 2011 : 18:01:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Subbenga Invia a Subbenga un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cari ragazzi niente. La mia ``culonia`` e` senza inserto. Ieri ho mandato 2 legazioni a differenti concentrazioni 6:1 e 60:1 ma niente (ovviamente gia` avevo provato 3:1. 2:1, 5:1. Ora a partire dal fatto che non mi fido di quello che mi hanno dato loro (plasmide) in questo lab, cosa possono avermi dato di sbagliato? E` un plasmide con pGL3 basic piu` un inserto di 2.2 Kb molto particolare ma alla fne inserito con KpnI e SmaI. Io taglio con KpnI ed un enzina che si trova 50 nt a valle di KpnI (SacI).
Taglio il plasmide e l`inserto. Del plasmide ne corro un po` su gel e vedo che e` linearizzato (molto diverso dal non tagliato che pure corro). In questo primo passaggio non posso sapere se KpnI e` tagliato ho aggiunto io la sequenza a monte dell`inserto GGTACC con 4 nt a caso GATA. Purifico e mando la seconda digestione. Mi taglia il frammento di 50 nt dell`inserto (lo vedo dal gel ma non posso valutare piu` niente sul vettore :(.
So` che per voi e` ancora piu` difficle di me senza vedere foto. Ma qualsiasi consiglio e` ben accetto!!!

Visto che purifico da gel potrebbero residui di gel impedire la ligazione? Il mio DNA e` 260/280 sempre poco oltre 2 ma 260/230 (0.28;0.05 e 0.06) fa schifo in sintesi.
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SpemannOrganizer
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Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 marzo 2011 : 18:17:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
c'è una cosa che nn ho capito, il tuo inserto è dentro sto vettore pGL3? perche tagli con KpnI e poi con SacI?dopo aver tolto il frammento di 50 nt rileghi il vettore doppiamente digerito?? Scusa ma nn ho capito molto bene... potresti essere piu' preciso?

260/280 dovrebbe essere intorno a 1.8. il valore che hai 260/230 è troppo basso (ma penso sia dovuto alla poca quantità di DNA che hai dopo le purificazioni)!

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Subbenga
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Inserito il - 02 marzo 2011 : 18:35:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Subbenga Invia a Subbenga un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si scusami e` che per me che ci sbatto la testa da 1 mese sembra tutto ovvio. Mi spiego meglio.
Ho un plasmide con pGL3 basic ed un pezzo di promotore. Mi serve lo stesso pezzo di promotore solo un poco piu` lungo quindi devo inserire un pezzo di 200 bp a monte del promotore che e` gia` nel plasmide. quindi taglio con un enzima che e` nel plasmide KpnI (usato anche da loro per inserire il loro pezzo e quindi proprio a confine tra vettore ed inserto) e SacI che ha un sito endogeno quindi nel promotore (30bp a valle del loro promotore). Quindi io rimuovo tra KpnI nel plasmide e nell`inserto che ho amplificato. KpnI nel mio inserto e` stato aggiunto per PCR mentre SacI e` ancora endogeno perche` i frammenti coincidono sul genomico. vorrei tanto farti un disegno :)
Grazie spero di essere stato piu` chiaro
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SpemannOrganizer
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Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 marzo 2011 : 19:07:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si' ora sei stato chiaro. Effettivamente 30 (o 50) bp sono pochine, è possibile vedere FORSE qualcosa della digestione su gel (ma io nn ne sarei tanto sicuro, sarà che le mie digestioni in genere mi danno frammenti dai 500 bp in su), ma sicuramente non riesci a distinguere se il tuo vettore è stato digerito completamente o no. In tal caso la defosforilazione è d'OBBLIGO (e si ritorna al discorso all'inizio del topic).Mi risulta, dando un'occhiata al sito della NE biolabs, che sia KpnI che SacI sono enzimi che lasciano estremità 3' protruding (e quindi il fosfato sarà recessivo, rispetto a 5' overhang). Estremità di questo tipo, cosi' come le blunt, sono notoriamente piu' difficili da defosforilare rispetto alle 5'. In questo caso io defosforilo a 50 °C almeno 15 minuti (ma anche 20-30' dovrebbero andare bene, anzi meglio). Tieni conto che io uso la CIAP della invitrogen e questo passaggio è consigliato nel datasheet. Non so se per altre fosfatasi tu possa eseguire lo stesso passaggio,dovresti vedere sul datasheet.

Discorso digestione: quanto tieni a digerire? Io terrei ALMENO 3 ORE a 37°C.

Discorso ligasi: tieni conto che la ligasi, come la fosfatasi sopra, lega piu' difficilmente estremità blunt e 3' recessive. Per ovviare a tale problema puoi incubare piu' tempo, aumentare concentrazione enzima (oppure atp pero' nn ti so dire quanto) oppure aggiungere un po' di peg 8000 che favorisce il "crowding" di queste molecolare ( ma anche in tal caso nn ti so dire quanto perchè nn l'ho mai usato).
Secondo me il tuo problema nn è il ratio inserto vettore ma la digestione/defosforilazione/ligazione
Facci sapere

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Subbenga
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Inserito il - 02 marzo 2011 : 19:48:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Subbenga Invia a Subbenga un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok voglio prima soffermermi sulla defosforilazione. Se il mio vettore rimane fosforilato dovrebbe richiudersi su se stesso. In questo caso il mio vettore tagliato dovrebbe ricircolarizzarsi e quindi crescere quando lo trasformo. Il mio controllo (trasformazione plasmide cutted con cellule invece e` sempre negativa, priva di colonie). Ti dico che le mie 50 bp escisse dal frammento le vedo benissimo. Quelle escisse dal plasmide non le vedo :(.
Per questo mi soffermero` di piu` sulla ligazione. Per ora. Non credi?
Grazie ancora
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SpemannOrganizer
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Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 21:53:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sicuramente una migliore defosforilazione aiuterà tanto, ma se ti si rilega senza inserto vuol dire che anche la doppia digestione non è completa.io giocherei su questi parametri,ma è ovvio che non ho la soluzione certa.possono essere tante cose.la cosa migliore in questi casi è cominciare a lavorare bene su un parametro alla volta,in modo da poter escludere quali passaggi sono stati fatti bene e quali no.

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Subbenga
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Inserito il - 02 marzo 2011 : 22:52:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Subbenga Invia a Subbenga un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
a me non rilega, Non mi e` mai cresciuto niente!!!quindi suppongo che la mia digestione e` buona!!!Percio` scarterei la fosforilazione a cosa potrebbe aiutarmi?
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SpemannOrganizer
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Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 23:30:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok,scusa avevo capito male.è che sopra avevi scritto che la tua culonia era senza inserto,avevo interpretato che alla fine ti fossero cresciute colonie ma senza inserto. Se plasmide è digerito e defosforilato,allora passiamo alla ligazione.ho visto che hai provato diversi parametri,Ma ciononostante non ti viene nulla.mi viene il sospetto che qualcosa sia scassato.hai la possibilità di usare un'altra ligasi?infine,potrebbe essere che l'inserto amplificato x pcr non sia digerito.hai controllato bene la sequenza dei primer?

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Subbenga
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Inserito il - 03 marzo 2011 : 00:38:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Subbenga Invia a Subbenga un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Proprio adesso ho mandato una ligasi O.N. la sequenza l`ho controllata varie volte :) sul tubo e` corretta. Se poi hanno sbagliato ad inserire la sequenza del mio enzima di restrizione non me ne accorgero` mai. Se va male questa prova ridisegno un altro primer. Il reverse va sicuramente bene perche` l`ho disegnato dopo la sequenza del mio enzima e dall`escissione rimuovo 50 nt e li vedo su gel. Grazie 1000
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


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Inserito il - 03 marzo 2011 : 01:39:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se avessi clonato in TA easy vector oppure in PJet insomma uno di questi te ne saresti accorto subito se i primers son giusto o meno
cmq anch'io stanotte ho mandato una ligazione 12 gradi O/N 7,4kb di vettore e 2,8 e 2,1 kb di inserto..in realta' e' un subcloning
cross finger ..e non ti stressare ^_^


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