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Chip a DNA
Il Chip a DNA (prodotto dalla Affymetrix) è un supporto di vetro di 1,28 cm^2 in cui vengono direttamente sintetizzati gli oligonucleotidi sonda; il supporto è suddiviso in molte aree, ognuna di 0,005 cm^2, contenenti 10^7 oligonucleotidi identici lunghi 20 basi che costituiscono una parte della
sonda per identificare un determinato gene. La sonda completa per un gene è costituita da 20 aree distinte, così ogni gene deve essere identificato in modo molto stringente da ben 20 sonde (identificando così anche varianti di splicing del gene). Inoltre per evitare l'ibridazione aspecifica ogni area è fiancheggiata da un'area di controllo. Queste aree di controllo contengono anch'esse 10^7 oligo i quali differiscono dagli oligo sonda veri e propri per una sola base nella zona centrale. Un gene viene considerato presente se si può evidenziare in maniera inequivocabile l'ibridazione con gli oligo
sonda, ma non con quelli di controllo.
DNAChip (Affymetrix)In particolare per i Chip a DNA si retrotrascrive in vitro l'mRNA a cDNA, il quale è, a sua volta, trascritto di nuovo in cRNA, utilizzando nella reazione in vitro dei nucleotidi marcati con biotina. Con questa reazione l'mRNA viene amplificato dalle 20 alle 200 volte. La miscela di cRNA viene sottoposta a frammentazione, dopo di che si può fare avvenire l'ibridazione. L'RNA legato può essere messo in evidenza utilizzando streptavidina coniugata con ficoeritrina (derivata dai ciano batteri, è un buon
fluoroforo). Il chip viene sottoposto a scansione, e la luce emessa viene catturata da un microscopio confocale che ne registra l'intensità. E' possibile poi risalire alla presenza o meno dei geni e quindi anche ad una determinazione quantitativa dei livelli di espressione. Si arriva ad avere
un'analisi quantitativa nell'intervallo di quattro ordini di grandezza di concentrazione.

 
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