Colture primarie di neuroni adulti
Descrizione
Questo protocollo descrive una tecnica per mantenere neuroni adulti di topo in coltura.
Poichè queste cellule non si riproducono è solo possibile farne colture primarie.
La migliore resa si ha con animali attorno ai 20-25 giorni, più difficile è la coltura di cellule da animali sopra i 40 giorni.
Ricoprire dei vetrini rotondi con polilisina (Vedi protocollo) e metterli in una multiwell (es. multiwell da 12 per vetrini da 13-14 mm di diametro). In alternativa si possono usare vetrini ricoperti di collagene.Consiglio
I seguenti passaggi non richiedono necessariamente sterilità, ma è ovviamente conveniente lavorare in un ambiente il più sterile possibile e sterilizzare su fiamma tutti gli strumenti utilizzati.
Prelevare il cervello, e metterlo immediatamente in ACSF tenuto in ghiaccio e ossigenato (5% CO2). PASSAGGIO IMPORTANTE
Con l'aiuto di un microscopio per dissezione, separare la regione di interesse, avendo cura di eliminare le meningi, se presenti. In alternativa è possibile utilizzare un vibratomo per tagliare sezioni piuttosto spesse (es. 400 micron) e poi separare i nuclei di interesse dalle sezioni. Questo passaggio è importante per arricchire la coltura in neuroni del tipo desiderato.Incubare la parte dissezionata in ACSF ossigenato a 30 ºC per 1-2 oreDa questo punto in poi lavorare sotto cappa sterile.Trasferire le parti isolate in PBS 1X sterile (o alternativamente HBSS) per sciacquarle velocemente.Trasferirle poi in 3 ml di 2.5% tripsina in PBS e incubare 30' a 37º, muovendo la provetta ogni 5-10 minuti, per meglio far digerire il tessuto. Alla fine del trattamento il tessuto dovrebbe essere ancora integro, ma molto fragile.Disgregare meccanicamente il tessuto, facendolo passare in una pipetta pasteur.Aggiungere ugual volume (3 ml) di Neurobasal Medium A + 5% FBS per bloccare la digestione.Centrifugare a 1500 rpm per 5 minuti.Rimuovere il surnatante.Opzionalmente si puo' velocemente sciacquare il pellet con PBS o con HBSS e ricentrifugare.Risospendere il pellet in 2 ml di Neurobasal Medium A (puro, senza aggiunta di glutamina, antibiotici o altro)Effettuare una conta vitale (con Trypan Blue) delle celluleAggiungere un'opportuna quantità di cellule su ogni vetrino (in generale è meglio una densità piuttosto bassa, ad esempio 10000 cellule per vetrino)Incubare 30' a 37ºAggiungere 2ml di medium completo per pozzetto (Neurobasal Medium A + glutamina 0.5 mM + Pen/Strep + supplemento B27)
Incubare a 37º. Cambiare metà del medium ogni giorno. I primi fenotipi gliali/neuronali si vedono a 3-4 giorni in coltura.Consiglio
È possibile arricchire la coltura in neuroni e/o glia tramite centrifugazione su gradiente di
Percoll o di
Optiprep.
