Immunocitochimica (ICC)

Descrizione

Questa tecnica permette di confermare la presenza di una proteina in cellule in coltura e di determinare la posizione a livello cellulare.

  • Partire da cellule cresciute su vetrini, oppure pipettare 100-200 µl di sospensione cellulare su di un vetrino da microscopio e incubare a 37C o/n.


  • Aspirare il medium di coltura e sciacquare delicatamente con PBS, facendo attenzione a non disturbare troppo le cellule.


  • Trattare con fissativo ghiacciato per un minuto. Si possono usare diversi fissativi, il risultato dipende dal tipo cellulare.
    I fissativi pi comuni sono:
    1% paraformaldeide in PBS
    95% etanolo / 5% acido acetico
    50% etanolo / 50% metanolo
    Acetone


  • Sciacquare delicatamente le cellule due volte per 5 minuti con PBS


  • Trattare le celllule con 8% BSA in PBS per 1 ora a TA in una camera umidificata per prevenire il disseccamento delle cellule.


  • Lavare 2 volte per 5 minuti con PBS


  • Rimuovere gentilmente l'eccesso di PBS e trattare con l'anticorpo primario per la proteina cercata diluito in 1% BSA in PBS. Incubare per 2-4 ore a TA.


  • Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS


  • Rimuovere gentilmente l'eccesso di PBS e trattare con l'anticorpo secondario coniugato con fluoresceina diluito in 1% BSA in PBS. Incubare per 1-2 ore a TA al buio in camera umidificata.
    Alternativamente possibile utilizzare altri tipi di anticorpi secondari (es. coniugati a perossidasi). Ulteriori passaggi possono essere necessari in quel caso.


  • Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS al buio


  • Montare il vetrino ed esaminare al microscopio a fluorescenza.



  • Tradotto e parzialmente modificato dal sito di Upstate