Batteri Competenti (metodo del CaCl2)

Descrizione

Classico protocollo per ottenere cellule competenti per trasformazione via Heat Shock.

  • Crescere un inoculo di cellule ON in 3 ml di LB, a 37C (o a 30C a seconda del ceppo)


  • Diluire il precedente inoculo in 300 ml di LB


  • Crescere a 37C ( o 30C ) fino a OD600=0.6


  • Incubare le cellule in ghiaccio per 10 min. Suddividere in falcon da 50 ml.


  • Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a 4C, scartare il surnatante.


  • Risospendere le cellule, delicatamente tenendole in ghiaccio, con 0.5 ml di 100 mM CaCl2, aggiungere 20ml di 100 mM CaCl2


  • Incubare in ghiaccio per 20 min.


  • Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a 4C, scartare il surnatante


  • Risospendere le cellule, delicatamente tenendole in ghiaccio, con 0.5 ml di 100 mM CaCl2, aggiungere 4 ml di 100 mM CaCl2


  • Incubare a temperatura ambiente 20 min.


  • Centrifugare 10 min a 3000 rpm.


  • Risospendere il pellet a 0.5 ml di 100 mM CaCl2 e aggiungere 0.12 ml di glicerolo 50%.


  • Congelare in Azoto liquido o ghiaccio secco ed Etanolo.


  • Conservare a 80 C.


  • Consiglio
    Utilizzare materiale sterile, preraffreddare il materiale plastico e la soluzione a 4C.


    PASSAGGIO IMPORTANTE

  • Le cellule rese competenti sono particolarmente sensibili, trattarle con delicatezza.