Titolazione per CPE50

Descrizione

Titolazione virale sulla base dell'effetto citopatico: si trova la concentrazione alla quale il virus causa il 50% di effetto citopatico sulle cellule

  • Piastrare le cellule in piastre da 96 (8x12), quando sono a confluenza (non totale) si infetta. L'infezione va fatta con varie diluizioni di virus: diluizioni seriali che arrivano fin dove serve (ad esempio 10^-8, ma per virus particolarmente concentrati va bene anche andare oltre).



  • Infettare con il virus ogni colonna. In ogni pozzetto delle piastre da 96 ci va fino a 100 µl, quindi per star sicuri si devono preparare almeno 1.8 o 2 ml di virus per ogni diluizione (diluizione che va fatta nel terreno di coltura), perché la cosa va fatta in doppio.



  • Per non rischiare di inquinare il pozzetto successivo, cambiare punta ad ogni diluizione. Il lavaggio prima dell'infezione è facoltativo. Si dividono le colonne da 8 pozzetti in due gruppi da 6 colonne (tipicamente che vanno da 10^-3 a 10^-8), in modo da avere appunto i doppi, dividendosi la piastra in due. Come puoi capire, per ogni punto dell'esperimento va usata una piastra completa (ad esempio, se hai 4 tempi devi piastrare e infettare 4 piastre). I risultati si leggono dopo 36-48h



  • Lettura dei dati.


  • Ogni colonna avrà una certa quantità di pozzetti con effetto citopatico, tipicamente a 10^-3 l'avranno tutti, a 10^-8 pochi o nessuno. Se si trova una concentrazione virale a cui tutti e due i duplicati risultano 4 pozzetti su 8 il titolo della CPE50 è quella concentrazione, cambiando di segno all'esponente (se la diluizione è 10^-6 il titolo è 10^6). Altrimenti va calcolato.

    Ci si segna su un pezzo di carta due colonne: una per la diluizione (10^-3, 10^-4...) e uno per i pozzetti trovati con effetto citopatico, ad esempio:

    10^-3 || 8/8
    10^-4 || 8/8
    10^-5 || 6/8
    10^-6 || 3/8
    10^-7 || 1/8
    10^-8 || 0/8



  • Fatto questo si fanno altre due colonne, una che mostra quanti pozzetti hanno effetto citopatico e una che mostra l'opposto, cioè quanti pozzetti non mostrano effetto citopatico. Nel nostro esempio:


    + || -
    8 || 0
    8 || 0
    6 || 2
    3 || 5
    1 || 7
    0 || 8



  • Ora bisogna fare delle somme. Per fare queste somme si rifanno le famose colonne: una che mostra le diluizioni, partendo dal basso all'alto, l'altra che fa la somma dei negativi; inoltre si aggiungono altre due colonne, una che mostra le diluizioni, partendo stavolta dall'alto al basso e una la somma dei negativi. Seguendo l'esempio:


    Dil || Som + |||| Dil || Som -
    10^-8 || 0 |||| 10^-3 || 0
    10^-7 || 1 |||| 10^-4 || 0
    10^-6 || 4 (1+3) |||| 10^-5 || 2
    10^-5 || 10 (4+6) |||| 10^-6 || 7 (2+5)
    10^-4 || 18 (10+8) |||| 10^-7 || 14 (7+7)
    10^-3 || 26 (18+8) |||| 10^-8 || 22 (14+8)


    Si scrivono così perché si sommano le prime dal basso, e le seconde dall'alto.


  • A questo punto possiamo renderci conto delle percentuali di effetto citopatico. Ancora tre colonne: la prima con le diluizioni, la seconda con il rapporto positivi/osservati, la terza con la percentuale. Il rapporto si ha confrontando i risultati ottenuti sopra, alla minima diluizione ho 26 pozzetti con effetto citopatico e 0 senza, quindi ho 26/26, alla terza, ad esempio (10^-5) ho 10 pozzetti con effetto citopatico e 2 senza, per un totale di 12 pozzetti osservati, quindi 10/12. Seguendo l'esempio:


    Dil || Pos/Oss || %
    10^-3 || 26/26 || 100%
    10^-4 || 18/18 || 100%
    10^-5 || 10/12 || 83.3%
    10^-6 || 4/11 || 36.4%
    10^-7 || 1/15 || 6.7%
    10^-8 || 0/22 || 0%


  • A questo punto c'è una formula: (percentuale > di 50% -50)/(percentuale > di 50% -percentuale < 50%), nel nostro esempio (83.3-50)/(83.3-36.4)=0.71

    Questo 0.71 lo sommiamo a 5, in quanto 5 è l'esponente della diluizione che ha dato il risultato immediatamente superiore al 50%, quindi abbiamo 5.71, questo numero lo usiamo come esponente di 10, quindi verrà 10^5.71, che equivale a 5.12x10^5 e quello è il nostro titolo espresso in PFU (Plaque Forming Unit).