Trasformazione per Heat Shock

Descrizione

Protocollo per trasformare batteri resi competenti con CaCl2 attraverso shock termico.

Consiglio
Utilizzare materiale sterile.



  • A 100 μl di cellule competenti ( se a -80░C lasciare scongelare lentamente posandole in ghiaccio) aggiungere 1-10 ng di DNA ( se proviene da una mini prep utilizzare 0.5-1 μl )


  • Incubare in ghiaccio per 30 min.


  • PASSAGGIO IMPORTANTE

  • Incubare a 42░C ( 37░C per ceppi termo sensibili) per 40 sec. (2 min. per i ceppi a 37░C). Riporre in ghiaccio per 2 min.


  • Aggiungere 0.8 ml di LB precedentemente riscaldato (42░C o 37░C ) e incubare a 37░C (o 30░C) per 30 min.


  • Centrifugare per 30 sec. in Eppendorf ed eliminare 0.8 ml di LB, quindi risospendere le cellule nel volume rimasto.


  • Piastrare 1/10 e 9/10 del volume in due piastre di agar contenenti gli opportuni antibiotici.


  • Crescere a 37░C O.N. ( o a 30░C) , capovolte.



  • Consiglio
    Per ogni esperimento occorre allestire anche un controllo negativo in cui non si aggiunge DNA.



  • Per calcolare l'Efficienza di Trasformazione
    Contare le colonie ottenute, moltiplicare per la diluizione di piastratura.
    Dividere per i ng di DNA utilizzato
    Efficienza di trasformazione (CFU/μg)=n░colonie /μgDNA