Titolazione per placche
Descrizione
Titolazione virale in cui si conteggiano le placche di lisi
Infezione in doppioVolume di infezione:
500ul x 2 dishes (quindi 1000ul)= 100ul di virus in 900ul di terreno;
1ml x 2 dishes (quindi 2000ul) = 200ul in 1800ulDiluizioni seriali 1:10 (una in più dell'atteso)Per l'infezione si usano solo le diluizioni seriali nel range (è inutile mettere 10^-1, di certo è troppo concentrato e non si vedrebbe alcuna placca, anzi sarebbe distrutto tutto il monostrato)
Dopo l'adsorbimento aspirare il terreno senza lavareSostituire il terreno con terreno-agarosio 0.6%. Importante: non fare bolle!Aspettare la solidificazione e incubare 4 giorni con le piastre rovesciateLettura
Soluzione crystal violetto 1% (attenzione: R22 R40 R41 R50 R53 S26 S36 S37 S39 S46 S60 S61, cioè, tra le altre cose, è cancerogeno)Si toglie l'agar e si colora 1ml/dish di cristal violettoAttendere 1 minuto e riscacquare con acqua corrente.Conta delle placche alle varie diluizioni (si deve fare una proporzione per normalizzare tutto ad 1ml a causa della diluizione seriale)Si prende la max potenza. Esempio:
10^5= nessuna placca (monostrato distrutto)
10^6= 94 e 92 (sono in doppio)
10^7= 14/12
10^8= 1/1
I numeri sono pressoché equivalenti. Prendiamo 94x10^6 --> 0.94x10^8:900ul=X:1000ul -->X=1,04x10^8pfu/ml è il nostro titolo.Fare la media tra i due pozzetti
