Trasfezione di plasmidi mediante lipidi cationici

Descrizione

Questo protocollo una guida per esperimenti di trasfezione di DNA plasmidico mediante lipidi cationi in cellule nervose immortalizzate ND26.

- Si preparano delle aliquote contenenti la soluzione di DNA plasmidico (8 µl + 2 l di NH4Ac + 25 l di etanolo 100% ) e si incuba over-night a -20C.

- Il giorno dopo si centrifuga per 20 minuti, si elimina il sovranatante e si effettuano due lavaggi con etanolo freddo 70% e uno con etanolo freddo 100%.

- Dopo centrifugazione si elimina il sovranatante, si lascia seccare il pellet sotto cappa per allontanare ogni residuo di etanolo e poi lo si risospende in 10 l di H2O sterile.

- Il giorno della trasfezione si aggiungono al DNA plasmidico 4 ml di mezzo senza siero, si agita su vortex brevemente e si lascia a 37C.

- Poi, si aggiungono 6 l di TRANSFAST (Promega), contenente i lipidi cationici e si incuba per 15 minuti a temperatura ambiente per favorire la formazione dei complessi lipide-DNA.

- Dopo aver ancora agitato mediante vortex, si aggiungono 400 l della soluzione contenente i complessi lipide-DNA per ogni pozzetto e si incuba per 1 ora a 37C, prima di aggiungere 800 l di mezzo completo e lasciare in incubazione per 48 ore.