Estrazione DNA da sangue intero

Descrizione

Questo protocollo pu essere utilizzato per estrarre DNA da sangue intero, fresco o congelato, o da buffy coat.

  • Mettere 5ml sangue in una provetta da 50ml


  • Aggiungere 15 ml di RCL Solution e agitare delicatamente per inversione per 10 minuti (non vortexare!)


  • Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 10 min


  • Eliminare il surnatante facendo attenzione che non si stacchi il pellet


  • Risospendere il pellet agitando su vorte


  • Consiglio
    se necessario eseguire un secondo lavaggio con altri 15 ml di RCL Solution


  • Aggiungere 5 ml di WCL Solution e vortexare per assicurarsi che le cellule siano lisate completamente


  • Incubare e 37C per 30 min


  • Aggiungere 2,6 ml di Protein Precipitation Solution e vortexare vigorosamente per almeno 25sec


  • Centrifugare a 13000 rpm (12000xg) per 10 min


  • Recuperare il surnatante che contiene il DNA in una provetta da 50ml


  • Aggiungere 2 volumi di Etanolo Assoluto a RT, agitare per inversione fino alla formazione del gomitolo


  • Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 5min per far precipitare il gomitolo


  • Eliminare l'etanolo assoluto e lasciar asciugare la provetta rovesciata su carta da banco


  • Aggiungere 3ml di Etanolo 70% freddo


  • Centrifugare a 3500 rpm (875xg) per 5min


  • Eliminare l'etanolo 70% e lasciar asciugare la provetta rovesciata su carta da banco


  • Dissolvere il DNA in H2Odist. sterile o TE da 200 a 600 µl a seconda della grandezza del gomitolo


  • Lasciar sciogliere il DNA o.n. a +4C