PCR

Descrizione

Un generico protocollo per PCR (polymerase chain reaction).
La PCR permette di amplificare una sequenza di DNA compresa fra due brevi sequenze per cui si costruiscono oligonucleotidi, detti primers.

  • Unire i seguenti componenti in un mix (lavorare in ghiaccio)

    Per ogni campione :

    2.5 l Buffer PCR 10X (senza Mg++)
    0.75 l MgCl2 50mM
    0.5 l dNTPs 10mM
    1 l del mix dei due primer a 25 pmol/l ciascuno. (questo pu variare a seconda del gene target)
    0.125 l Taq (5U/l)
    18.125 l acqua milliQ sterile

    Per un totale di 25l a campione (se la PCR preparativa si vorranno scalare questi valori in modo da ottenere un volume finale maggiore).



  • Consiglio
    Pu essere utile considerare 1 campione in pi ogni 10/15 per compensare eventuali piccoli errori nel pipettamento.



    Consiglio
    Conviene mettere la Taq come ultimo reagente e tirarla fuori dal frigorifero solo prima dell'uso (come in generale tutti gli enzimi).



  • Dispensare 23l della mix in provette da PCR.


  • Aggiungere 2l del DNA da amplificare. La quantit da aggiungere ovviamente varia a seconda del gene da amplificare.

    ATTENZIONE: se la PCR semiquantitativa i campioni di DNA vanno prima dosati (con lettura a 260 nm allo spettrofotometro) e diluiti tutti alla stessa concentrazione. Questo passaggio non necessario per PCR solo qualitative.



  • Inserire le provette nel termociclatore usando un ciclo appropriato per il gene di interesse.

    Un ciclo generico pu essere:

    2' a 95C

    35-40 cicli di:
    30" a 95
    45" alla temperatura di annealing dei primers (55-60)
    1'30" a 72

    10' a 72
    4 fino all'utilizzo



  • Creare un gel di agarosio per visualizzare i prodotti.



  • Dissolvere 0.5-2% (dipendentemente dalla lughezza del prodotto) di agarosio in TAE o TBE.


  • Mettere nel microonde per circa 1-2 minuti o fino a che la soluzione non diventa trasparente.


  • PASSAGGIO IMPORTANTE

  • Aggiungere circa 7 l di EtBr per 50ml di agarosio.
    ATTENZIONE: i vapori di EtBr sono molto tossici. Lasciare raffreddare brevemente la soluzione di agarosio prima di aggiungere EtBr, ed evitare comunque di respirarne i vapori. Lavorare sempre con i guanti.


  • Versare l'agarosio nel gel-caster, mettere il pettine e aspettare che il gel si sia solidificato.


  • Aggiungere 3l di PCR loading buffer al campione e caricare i campioni sul gel.


  • Visualizzare il risultato al transilluminatore UV.