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Mrselfdestruct
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
 Inserito il - 14 giugno 2007 : 14:51:53
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Ciao a tutti,
devo affrontare una quantificazione assoluta tramite Real Time PCR e volevo chiedervi un suggerimento sull'interpretazione dei dati.
Mi ricordo che esiste una formula per quantificare il mio DNA senza fare tutte le volte la standard curve (sarebbe un bel risparmio di tempo, visto che dovrò fare uno screening molto ampio!)
Ringrazio in anticipo chiunque mi sappia aiutare!
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LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2007 : 20:44:55
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ciao, non conosco questa formula per evitare di fare tutte le volte la standard curve, mi sembra però un po' improbabile perchè come ben saprai tutti i tuoi campioni devono avere lo stesso slope e come fai a saperlo senza standard curve? puoi usare sempre lo stesso valore soglia ma è difficile standardizzare una real-time. boh non so, comunque se questa formula esiste ed è attendibile sarei più che contenta di utilizzarla evitando tutte le volte di rifare lo standar |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2007 : 23:40:40
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| Puoi leggere l'OD a 260 ma è piuttosto approssimativa come misura. E' sempre meglio fare una curva standard e mettersi l'animo in pace piuttosto che dover rifare tutto l'esperimento perchè i risultati non vengono riproducibili :) |
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Mrselfdestruct
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2007 : 12:04:06
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Il fatto è che io voglio vedere se c'è una duplicazione del mio gene d'interesse, quindi non ho bisogno di essere molto preciso nella quantificazione, voglio solo sapere se questo gene è presente 1x o 2x.
Forse adesso mi sono spiegato meglio e qualcuno ha altri suggerimenti!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2007 : 15:23:44
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| Beh, allora non ti serve nemmeno la curva standard. Puoi fare semplicemente una multiplex con 18S e il tuo gene e guardare i delta Ct. |
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Mrselfdestruct
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2007 : 09:46:09
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| chick80 potresti spiegarmi un pò più in dettaglio come impostare questa multiplex? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 giugno 2007 : 12:52:56
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Allora, innanzitutto per fare una multiplex devi usare un approccio tipo TaqMan o Scorpion (si chiamano così?) e non SYBR Green.
In ogni campione metti sia i primers+sonda del tuo gene d'interesse sia i primers+sonda del 18S. Ovviamente le 2 sonde sono coniugate a fluorofori diversi.
A questo punto fai la tua realtime ed ottieni dei valori di ciclo soglia (Ct) per il 18S e per il tuo gene X e puoi calcolare i delta Ct come Ct del gene X - Ct del 18S.
Il deltaCt dei campioni 2X sarà < di 1 rispetto a quello dei campioni 1X.
La sensibilità di questo approccio probabilmente dipende da quanto è espresso l'mRNA di X e dalla bontà di primer e sonde, ma vale la pena fare una prova se stai già usando TaqMan. (se invece stai usando SYBR Green forse non vale troppo la pena perchè con TaqMan vai a spendere molto di più).
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Mrselfdestruct
Nuovo Arrivato
8 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2007 : 10:39:02
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Grazie mille chick!!
Ci proverò... |
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Quantificazione assoluta con Real Time
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