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reshma
Nuovo Arrivato
Prov.: vr
Città: verona
5 Messaggi |
 Inserito il - 20 gennaio 2009 : 14:56:55
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ciao a tutti!dopo 3mesi di PCR i risultati non arrivano!!forse qualcuno può aiutarmi!!
scopo del lavoro:
trovare la sequenza della carbonico anidrasi di Cygnodraco mawsoni(pesce antartico)
Non conoscendo la sequenza abbiamo cercato in banca dati le sequenze della carbonico anidrasi di altri pesci.
Inizialmente abbiamo fatto un allineamento di tutte le specie e abbiamo costruito i primer su queste sequenze.
Risultato? zero!
poi abbiamo cercato di limitare il numero di specie a quelle filogeneticamente più vicine al nostro pesce.
Gli allineamenti davano regioni conservate più lunghe e su queste abbiamo costruito dei nuovi primer.(sia degeneri che specifici)
Veniamo al punto...zero risultati ancora!
Abbiamo controllato che il dna non fosse degradato, abbiamo provato T annealing diverse, abbiamo rifatto tutte le soluzioni e comprato materiale nuovo,(x escludere contaminazioni) pipette, puntali provette sterili.Le concentrazioni dei primer, della pfu, dei dNTPs e del templato dovrebbero essere giuste(quelle del Mg sono sicura...il buffer era presente nel kit della pfu).
Quindi mi verrebbe da pensare che il problema siano i primer(di nuovo)...qualcuno ha dei consigli???grazie a chi potrà illuminarmi!!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 15:11:40
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copio e incollo il messaggio inserito da reshma in un altro post
sono sempre io...dimenticavo...
Abbiamo anche controllato che i primer avessero una lunghezza giusta, che il contenuto in G-C fosse compreso tra il 40%/50%, e i programmi al pc per la costruzione dei primer ci dicono che non danno dimeri o forcine.
Facendo correre i campioni dopo la PCR e confrontandoli con 1ladder da 100bp abbiamo sempre delle bande molto basse...all'altezza di 100bp mentre il rislutato corretto dovrebbe dare bande verso i 300/500 bp.
Grazie ancora!! |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 16:11:23
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Partendo dal presupposto che questo benedetto pesce abbia delle sequenze simili agli altri. Se fossi in te proverei con un altro enzima, io non l'ho mai usata, ma da quello che diciono molti, la pfu può dare dei problemi specie se utilizzi le concentrazioni riportate nel kit (che risultano essere troppo basse). Se fai una ricerca nel forum credo che ci sia qualche discussione al riguardo.
Però visto che il risultato non è sicuro, non la sprecherei così. Prova la reazione con una taq più spartana (ed economica).
Avete provato ad amplificare un'altra sequenza del DNA di cui siete sicuri venga fuori qualcosa? Giusto per essere sicuri dell'amplificabilità del DNA estratto. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 17:18:48
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concordo a pieno,
verifica prima con una taq più robusta e soprattutto su un tratto del genoma diverso e su cui se più sicuro, tipo actina etc
fai un passo alla volta, altrimenti non sai se è una questione di protocollo, taq, dna, primers, condizioni di pcr, buffers, dNTP etc.
in bocca al lupo
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2009 : 16:01:27
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Concordo con chi mi ha preceduto...useri una bella Taq robusta, ce ne sono di buone e molto performanti di diverse ditte...la Pfu in genere è più fedele, perchè proofreading, ma molto molto meno processiva e nel tuo caso specifico dove non sei sicuro della sequenza hai bisogno di massima processività..dal momento che ogni nucleotide diverso da quello da te disegnato ti fa abbassare l'efficienza di annelaing....
concordo anche di usare un controllo per le condizioni..un housekeeping qualunque (actina, GAPDH, beta2Microglobulina etc, a seconda di come siete abituati o meglio diq eullo di cui avete la sequenza o una pseudo-sequenza)
Incrociamo le dita x te!! |
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reshma
Nuovo Arrivato
Prov.: vr
Città: verona
5 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2009 : 16:38:23
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grazie a tutti per i consigli!effettivamente alla fine abbiamo provato con la GoTaq e finalmente sono arrivati dei risultati!!oddio...le bande non sono bellissime però almeno c'è qualcosa! |
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Pcr negative!
Didattica
