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82biotec
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 25 gennaio 2009 : 16:28:31
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Ciao a tutti, sono biotecnologo e sono al primo anno di dottorato;)
Tra i vari progetti affidatimi, ne ho una realtinvo al silencing mediante trasfezione di cellule endoteliari.
Purteoppo nel mio corso di studi non ho mai fatto una trasfezione, ne ho viste fare e ne ho studiato i principi, ma come tutti sappiamo un conto è conoscere i principi..un altro è farle;)
allora essenzialmente il problema è che devo trasfettare delle cellule endoteliari che sono piuttosto refrattarie. Visto il suo grande uso,pensavo di adoperare la lipofectamine nel quale inserirò un plasmide che devo farmi col gene che voglio silenziare, un reporter e la resistenza. Il mio target è un gene che ho visto essere silenziato dal miR21.
Volevo quindi sapere se qualcuno trasfetta cellule endoteliari e se puà darmi qualche consiglio (putrtoppo nel mio gruppo sono l'unico che ha una base molecolare quindi devo fare tutto da solo e senza possibilità di guide e confronti).
Ho anche visto un kit anbion che permette di trasfettari preculsori miRNA tal quali, senza bisogno di plasmidi o altri vettori.
Consigli...dritte?
Grazie a tutti
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2009 : 16:35:03
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| Ma sono primarie o è una linea? no perchè cambia tutto... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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82biotec
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2009 : 17:12:12
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sono linee primarie.
Praticamente il mio è uno studi sull'aging delle cellule endoteliari.
Devo vedere il ruolo che il miRNA21 ha su un gene che ho visto essere importante in tale processo (array più validaz con qPCR già fatta)
Devo qundi trasfettare con un vettore con il mio miRNA (e anche un antimiRNA) per vedere se c'è up o down regulation.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2009 : 18:41:15
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Allora non so quanto la lipofectamina potrà esserti d'aiuto.
In genere con le primarie è il caso di affidarsi a un vettore
lentivirale: credo che con miRNA21 ne esistano di già disegnati
e forse pure in commercio. Prova a fare una ricerca su pubmed
usando come keywords il miRNA e LV o lentiviral vector.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2009 : 19:17:30
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Comunicazione di servizio.
Mi è stato fatto teneramente notare (:D)
che se sono primarie, allora per motivi
di carattere terminologico non possono
essere "linee", perchè la parola linea
presuppone che derivino da altre colture.
Invitiamo a prestare attenzione
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82biotec
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2009 : 22:21:48
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lo so..ma nei testi sono classificate come primary cell line.
avevo gia trovato un lavoro del 2001, dove sono stati comparati metodi di trasfezione dell HUVEC con sostanze lipidiche (kit vary), vettori lentivirali e metodo calcio fosfato.
Lo studio riporta i seguenti dati rispetto alle efficienze di trasfezione:
complessi lipidic poco sopra lo 0.5 %
vettori lentivrali 5%
CalcioFosfato 60%
ho poi visto che in commercio esistono kit specifici per le HUVEC...ma nn vorrei fosse una vendita di fumo.
credo che tenterò col metodo calciofosfato per iniziare e vedere che succede, visto il successo avuto nell'articolo da me citato.
Grazie per le risposte e si accettano ulteriori infos e suggerimenti. |
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Strawberry
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2009 : 18:26:44
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Mi interesserebbe avere questo paper del 2001, ti ricordi il titolo?! gli autori ?!
Grazie..
p.s. ho un problema analogo al tuo ;) |
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