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nelli
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 18 marzo 2010 : 11:36:09
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Salve a tutti, ho un problema di corsa con il w.b. infatti il marker mi migra ad imbuto e inoltre ho anche problemi col trasferimento, non riesco a trasferire tutte le proteine.
Utilizzo membrana PVDF attivata in metanolo, il buffer di trasferimento (2 L, pH 8.3) è costituito da 28.8g di glicina, 6.06 di TRIS, 400 ml di metanolo(20%) portato a volume con H2O distillata. Trasferisco over night a 25 V e il mattino successivo aumento il voltaggio a 50 V per 1 ora. Per raggiungere il pH uso NaOH.... è un problema?
Inoltre ho notato che sulle lastre, anche dopo aver strippato le membrane e utilizzato altri Ab, osservo sempre le stesse bande... come mai?
Grazie per l'aiuto 
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2010 : 14:16:20
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per i problemi di trasferimento:
prova a trasferire ad amperaggio costante (tipo 0,04 Ampere O/N)
per la corsa ad imbuto:
lascia polimerizzare bene il gel, anche overnight in frigo
per lo stripping:
che protocollo usi? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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nelli
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 09:52:36
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X 100 ml di stripping:
- 20 ml di SDS al 10%
- 12.5 TRIS HCl 0.5 M pH 6.8
- 67.5 ml di H2O
- 0.8 ml di beta mercaptoetanolo
Inoltre quando sviluppo c'è molto background e il segnale non è nitido.
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 10:21:42
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In genere non c'è bisogno di pHare il buffer di trasferimento (192 mM glicina 25 mM tris 20% metOH). Con questa composizione dovrebbe già avere un pH 8.2 - 8.4. Aggiungere acidi o basi, per quanto ne so, può dare problemi.
Ciao |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 13:09:42
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| Sì, ok, ma quanto tieni a strippare ? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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nelli
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2010 : 14:56:30
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Hai ragione ....Strippo per 30 min a 50°C; effettuo 2 lavaggi con pbs+tween da 15 min ciascuno e poi latte per 1 h e successivamente Ab 1 e così via.
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