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agnes
Nuovo Arrivato
Prov.: Savona
Città: albenga
11 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2006 : 15:50:28
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ciao...scusate vorrei sapere una cosa circa l'elettroforesi:qualche giorno fa in laboratorio ho fatto la digestione del DNA e poi l'elettroforesi su gel d'agarosio...della stessa reazione ho caricato 4 pozzetti(non so perchè!).non ho capito perchè solo quella volta non mi hanno fatto fare la foto agli UV perchè il DNA poteva danneggiarsi...della stessa reazione mi hanno fatto caricare 4 pozzetti...boh!(non sono in italia e mi spiegano tt in inglese!)
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2006 : 01:10:55
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Di solito se sono prodotti lunghi che devi poi clonare è meglio non esporre il DNA per troppo tempo agli UV, altrimenti il DNA si potrebbe danneggiare.
Se devi clonare devi tagliare la banda dal gel e quindi comunque lo esponi agli UV (anche per conrollare che hai nel gel!!!), ma chiaramente per un tempo minore.
Questo spiegherebbe anche i 4 pozzetti... Quando serve una grande quantità di DNA si fanno le reazioni in grande, poi o si caricano su un grande pozzetto (realizzato di solito unendo piu' pozzetti con lo scotch), o semplicemente su più pozzetti!
Questa potrebbe essere una spiegazione, però non so.
Facci sapere..
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agnes
Nuovo Arrivato
Prov.: Savona
Città: albenga
11 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 10:25:53
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grazie 1000,
si penso che sia la spiegazione giusta,anche perche´ho cercato di farmi spiegare un po meglio e piu o meno mi hanno detto questo!!!
avrei un altra domanda...:perche´nella preparazione della reazione della PCR si aggiunge MgCl2?
io ho cercato su internet ,ma nelle reazioni che ho trovato non cé questo "ingrediente"!
grazie ancora a tutti
a prestooooooooooo |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 10:53:15
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Bhe, il magnesio è un cofattore della Taq! Per quello si aggiunge!
Per curiosità, dove sei di bello?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 11:38:38
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Per quanto riguarda l'MgCl2 di solito è già contenuto nel buffer che metti nella mix di PCR (forse è per questo che non l'hai trovato su internet  )
Comunque in genere si usa ad una concentrazione di 1,5mM (già contenuta nel buffer), in alcuni casi si aumenta la concentrazione di MgCl2 per aumentare la resa della PCR.
P.S. per quanto riguarda l'esposizione del gel agli UV io uso un'altro metodo:
Semino parte della reazione di PCR in un pozzetto piccolo e tutto il resto in uno grosso (ottenuto come dice Valia nendo i pozzetti con lo scotch), poi taglio il gel verticalmente in mezzo tra pozzetto piccolo e pozzetto grosso.
Porto solo la parte con il pozzetto piccolo sopra gli UV e excido la banda che mi interessa. Poi lontano dagli UV riconpongo il gel ed excido la banda (allo stesso livello) anche dal pozzetto grosso... così il pezzo che recupero non viene minimamente esposto agli UV!!!
Infine per controllare porto tutto il gel rimasto sotto gli UV e controllo che non sia rimasta la banda su gel!
E' un po' laborioso e ti porti dietro un po' più di agarosio... però eviti il contatto del DNA con gli UV! |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 11:46:15
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apper˜!!!
bella tecnica GFPina!
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 15:09:38
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In realtà non tutti i kit di PCR contengono l'MgCl2 nel buffer anzi.....
Solitamente quando una reazione di PCR va messa a punto si variano le condcentrazioni del Magnesio per prima cosa e poi il resto.
Personalmente diffido sempre delle taq alle quali non puoi variare le condizioni di reazione
Salutoni |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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agnes
Nuovo Arrivato
Prov.: Savona
Città: albenga
11 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2006 : 12:01:42
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grazie1000!
sono in Danimarca in Erasmus....Aarhus!!!
a presto e grazie ancora!
Citazione:
Messaggio inserito da valia
Bhe, il magnesio è un cofattore della Taq! Per quello si aggiunge!
Per curiosità, dove sei di bello?
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elettroforesi
Didattica
