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froggyb
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17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 10:22:53

ciao a tutti!!! ho un problema: non riesco ad esprimere una proteina.
sono riuscita ad inserirla in 2 plasmidi diversi ma in nessun caso ho avuto l'espressione!!! le analisi di sequenza vanno bene, ma non si induce.
cosa devo fare???
HELP!!!!

Daria85
Utente

678 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 10:44:28

mmm...non � che magari la proteina espressa non � abbastanza stabile( ovviamente se � endogena).
magari viene velocemente degradata, e per questo non sei in grado di ritrovarla...
hai provato dei sistemi di espressione cell-free?

ciao

froggyb
Nuovo Arrivato

17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 11:37:19

grazie per avermi risp cos� velocemente.
la proteina non � endogena.
inoltre faccio dei prelievi dopo 3 ore dall'induzione e anche over night.
su gel non si vede alcuna banda.

froggyb
Nuovo Arrivato

17 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 11:54:09

per quanto riguarda l'espressione cell-free, dopo l'induzione dovrei ultracentrifugare le cellule ed analizzare il lisato su gel??

Daria85
Utente

678 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2011 : 14:09:43

se � cell-free non ci sono cellule!:)
� un sistema in vitro che permette di sintetizzare una determinata proteina semplicemente utilizzando estratti cellulari eucariotici o procarotici.
una volta avvenuta la sintesi potrai isolare la tua proteina

ma domanda, in che cellule stai lavorando?
perch� essenda la tua una proteina di secrezione ci sono diverse cose che potrebbero inficiare la resa, e quindi potresti aver bisogno di stabilizzare la secrezione...
per esempio il peptide segnale potrebbe dare dei problemi, e quindi magari la tua proteina � sintetizzata, ma nn viene secreta.

froggyb
Nuovo Arrivato

17 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2011 : 10:47:57

la mia proteina � un fattore di trascrizione. sto lavorando con le BL21.
inoltre ho un p� guardato su internet ed ho visto che ci sono proprio dei kit per il cell-free
che nn possiedo e non ne s� molto a riguardo....
intanto riprovo le induzioni...
cmq grazie!!!

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