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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2011 : 20:55:45
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Sto facendo dei clonaggi utilizzando il sistema gateway.
I miei plasmidi Donor, sono insensibili alla selezione negativa!!!
Questi plasmidi sono fatti in modo da non far replicare la cellula batterica se non ricevono un inserto con cui ricombinare, in questa maniera se la reazione di ricombinazione ha successo, perdono la selezione negativa e possono crescere su piasta. Crescono quindi solo i plasmidi che hanno correttamente ricombinato con l'inserto (amplificato da pcr).
MA..........se io trasformo le cellule con il solo plasmide donor, senza che abbia ricevuto l'inserto ( non faccio proprio la reazione di ricombinazione), il giorno dopo mi ritrovo una marea di colonie -.-'
1)Probabilmente il plasmide ricombina col genoma batterico in qualche maniera....ho traformato fin ora con 3 ceppi di batteri diversi, sempre il medesimo risultato, crescono.
2)Quel plasmide ha accumulato qualche mutazione sulla selezione negativa, per cui cresce anche se non ha ricevuto l inserto....peccato che questo fenomeno l ho riscontrato con altri 2 plasmidi Donor differenti, e pensare che tutti e 3 siano mutati la vedo improbabile.
3)I plasmidi non sono "nuovi", ci sono arrivati da un altro laboratorio, può essere che già sono ricombinati e hanno un qualche inserto a posto della selezione negativa. Ho sequenziato 3 cloni, e c'è tutto quello che deve esserci....
Non so bene come procedere, l' alternativa è ricomprarli nuovi dalla Invitrogen, ma attualmente non ho la certezza che con i plasmidi nuovi questo problema non si ripresenti.
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2011 : 22:26:44
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Ma che cloni hai sequenziato? Dici solo che c'é tutto quello che serve ma non hai specificato cosa sono.
Comunque la cosa é molto strana, a meno che tu non stia utilizzando delle cellule apposta che sono insensibili all'effetto di CcdB, quindi non muoiono.
Io proverei a sequenziare i tuoi Donor vector per accertarmi che ci sia il gene ccdB, non i cloni, proprio il vettore di partenza. |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2011 : 23:05:59
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i miei cloni derivano dal plasmide di partenza, fatto crescere in cellule apposite tolleranti al ccdB.
hanno sia il ccdb che il gene per la resistenza al cloranfenicolo, la mia paura era quella che il plasmide iniziale fosse arrivato ricombinato e quindi senza la ccdb, ma non è così.
altra cosa ho provato a farli crescere in terreni kanamicina-cloranfenicolo e crescono, quindi è proprio qualcosa che non va nella sequenza ccdb. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 10:26:24
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| quindi potrebbe essere una mutazione nel ccdb o, se è vero che la sequenza è ok, la mutazione potrebbe essere nel promotore di ccdb. |
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