Ciao a tutti volevo chiedervi se potevate chiarirmi alcuni dubbi sulla tecnica gateway. Leggendo il protocollo della invitrogen ho letto che ci sono più tecniche per far entrare il mio DNA di interesse nel vettore pENTR e che oltre ad usare i siti att e quindi fare tutti i passaggi mediante PCR mi sembra di aver capito che posso eventualmente clonare direttamente il mio DNA dentro il pENTR usando enzimi di restrizione e poi una volta clonato nel pENTR clonarlo nel pDEST è corretto oppure è necessario effettuare tutti i passaggi per ottenere il dna con le sequenze di ricombinazione? Grazie
Da quel che so io, devi per forza amplificare il tuo prodotto di PCR con primers che contengano i siti attB, in modo poi da fare una ricombinazione BP con un donor vector (avente i siti attP) e ottenere l'entry clone con i siti attL. Dalla ricombinazione tra il tuo entry clone (attL) e di un destination vector (attR) ottieni il tuo clone di espressione...
Sì certo che si può! Puoi benissimo inserire in un vettore pENTR un frammento con "clonaggio classico" perché tra i due siti attL c'è il MCS (multiple cloning site).