Ho disegnato diverse coppie di primers che a breve arriveranno (spero!!!). Al loro arrivo dovrò testarli in modo da capire quali coppie amplificheranno e quali no. Come fare? PCR? Ci sono particolari accorgimenti cui prestare attenzione?
Ciao! Devi usare i primers per amplificare una sequenza? Hai giá calcolato le temperature di melting dei vari primers? Sono temperature che non differiscono di piú di 5ºC? Hai controllato se i primers formano hairpins o hanno regioni che possono causarne l'appaiamento tra di loro? Puoi controllare se i primers funzionano e qual'é la temperatura ottimale di annealing dei primers con la tua sequenza facendo una PCR. La temperatura di annealing da utilizzare di solito é corrispondente alla temperatura di melting meno 5ºC. Se per esempio hai due primers con Tm di 59ºC e 61ºC, usare una temperatura di annealing di 56ºC di solito da buoni risultati.
Nella scelta dei primers ho semrpe cercato di evitare quelli che, da impostazioni teoriche del programma, potessero dare dimeri e Hairpins. Le temperature di melting, poi, poichè i primers li ho progettati per poter lavorare in multiplex, sono tutte intorno ai 59°C.