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andrea78
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 22 novembre 2008 : 23:15:54

Chi mi saprebbe spiegare bene la differenza di una curva standard per quantificazione relativa rispetto ad una curva standard per quantificazione assoluta nella real-time PCR

marok
Utente Junior

150 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2008 : 10:13:56

La curva per quantificazione assoluta si fa attraverso uno standard di cui conosci esattamente il numero di copie ad es: hai una soluzione stock che contiene 10^6 copie di bersaglio. Fai le relative diluizioni e il tuo campione pu� essere esattamente quantificato. Invece per la quantificazione relativa la tua curva la fai con uno standard di cui conosci solitamente la % di sequenza bersaglio rispetto a quelle totali per cui facendo una quantificazione avrai una percentuale sul totale e non una quantit� assoluta.

andrea78
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2008 : 00:30:20

Citazione:
Messaggio inserito da marok

La curva per quantificazione assoluta si fa attraverso uno standard di cui conosci esattamente il numero di copie ad es: hai una soluzione stock che contiene 10^6 copie di bersaglio. Fai le relative diluizioni e il tuo campione pu� essere esattamente quantificato. Invece per la quantificazione relativa la tua curva la fai con uno standard di cui conosci solitamente la % di sequenza bersaglio rispetto a quelle totali per cui facendo una quantificazione avrai una percentuale sul totale e non una quantit� assoluta.

Grazie per la risposta..Ok per la assoluta va bene.. ma per la relativa.. come faccio a sapere dello standard quale � la sua % rispetto al totale e poter cos� costruire la curva?.. da quanto intendo dovrei partire da diluizioni di cDNA preparato dall'RNA totale, amplificare il mio target con la real-time PCR e mettere in relazione il Ct ottenuto con il quantitativo di cDNA utilizzato?

marok
Utente Junior

150 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2008 : 13:18:00

Quello era un esempio che credo non valga per gli studi di espressione. Comunque gli standard a % note si comprano

. Per lo studio di espressione devi normalizzare i tuoi dati con un gene endogeno che ne so ad esempio l'actina, che sai che non varia tra la condizione di controllo e quella del trattato. Utilizzi una curva fatta con l'actina (es con plasmidi al cui interno hai clonato il gene), poi fai una real-time sia per l'actina che per il gene di interesse sia nelle condizioni di trattato che di controllo e cos� puoi dire di quante volte il tuo gene di interesse ha aumentato o diminuito l'espressione usando come normalizzatore l'actina.
Questo era solo un esempio ipotetico perch� ci sono varie strategie per le quantificazioni relative che dipendono da cosa vuoi quantificare (ad esempio io non mi occupo di studi di espressione e utilizzo un metodo che richiede due curve standard).
Se non sono stato chiaro o hai altre domande chiedi pure.

farmacologia
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2009 : 06:59:17

Dallo schema sotto riportato posso immaginare che si tratti di una Real Time assoluta?
E in parole molto povere, cosa far� la real time?
qui le curve standard sono due: uno per il gene target e l'altra per l'Hk.
Di che tipo di tecnica si tratta?

Immagine:

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