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 PCR: controllo negativo amplificato
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Mar84
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 21:08:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mar84 Invia a Mar84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, sono ancora io..
brevemente: sto cercando di amplificare da qualche giorno DNA del suolo con la coppia di primers ITS1f/ITS4 .
Nelle prime prove per ottimizzare il programma di amplificaz e concentrazione di DNA non mi amplificava nulla..poi ho raddoppiato il tempo di accopiamento passando da 30 secondi a 1 minuto e cosí esce una banda anche nel controllo negativo. Escludo che si tratti di contaminazione visto che con il programma precedente nn amplificava nulla..
Un'altra cosa che ho notato é che esce una banda nel controllo negativo peró non in tutti i campioni e penso che questo sia dovuto che magari in questi ultimi vi é qualche inibitore della pcr (trattandosi di DNA del suolo é comune la presenza di inibitori es acidi umici ecc) ...cosa ne pensate?
Come potrei risolvere il problema? Grazie mille a chi puó consigliarmi ciao

gilthanas
Nuovo Arrivato

0116_da_CIA



100 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 21:54:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gilthanas Invia a gilthanas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora....
quando si parla di PCR e ci sono problemi, per risolverli ci sono sempre mille possibilità...che può essere anche uno svantaggio...
mi mancano, per capire e darti suggerimenti, alcune informazioni...conosci la dimensione del prodotto atteso? la banda che viene fuori anche nel controllo negativo che dimensioni ha? le stsse dell'atteso? non credo...se sono piccole potrebbere benissero essere primer dimers...ossia strutture secondarie dei primers che si appaiano tra di loro...e spesso capitano...

ci sono varie possibilità...
abbassa un pò la temperatura di annealing
modifica anche il tempo di annealing
aggiungi cicli
modifica la concentrazione di Magnesio
aggiungi DMSO nella reazione
aggiungi PEG nella reazione
al peggio cambia taq (ah tra parentesi, stai usando Taq o Pfu??)

tutte varie possibilità...da provare separatamente...la prima in genere che si tenta è cambiare e quindi abbasare la temperatura di annealing..poi se vengono fuori anche bande aspecifiche ci si pensa successivamente a pulirla...l'impirtante è ottenere l'amplificato..

se rispondi alle domande magari ci possiamo pensare meglio...
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Mar84
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 23:03:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mar84 Invia a Mar84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie per la risposta..
allora l'amplificato, tutto della stessa grandezza, ha la stessa dimensioni in tutti i campioni ed é piú piccolo dell'amplificato atteso..anche io ho pensato che siano dimeri...come enzima uso la taq (ho solo questo a disposizione)..
quindi se ho capito bene mi conviene la prima prova solo abbassare la temperatura di annealing (nn toccare il tempo per ora?) che é di 55º .. a quanto mi consiglieresti provare?
grazie ancora ciao
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 23:34:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Potresti quantificare meglio "più piccolo" e "più grande".

I dimeri di primers sono comunque molto piccoli attorno a 50bp, non so niente di DNA da suolo, ne tanto meno dei primers che hai utilizzato, ma se la banda che ottieni non è del peso atteso e sopratutto se è molto diversa ci sono sicuramente dei problemi!
Se leggi qua, pare che tu non sia l'unica ad avere problemi con questi primers, a 55°C non funzionano bene! Non dicono però a che temperatura li hanno utilizzati.
Inoltre l'amplificato da una banda debole!
Prova a vedere se trovi altre info in letteratura e nel caso varia i parametri ad uno a uno come dice gilthanas.

Ma:
Citazione:
poi ho raddoppiato il tempo di accopiamento passando da 30 secondi a 1 minuto

come tempo di accoppiamento non intendevi l'annealing?
In genere si varia la temperatura più che il tempo.
Prova a temperature inferiori per rendere meno stringente l'appaiamento e casomai aumenta il numero di cicli, queste sono le prime prove da fare!

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mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2009 : 11:18:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Fino a qualche anno fa lavoravo solo ed esclusivamente su campioni ambientali, tra cui anche suolo.
Solo che le informazioni che dai sono un po' pochine...
E poi, come giustamente dice GFPina, dacci maggiori info sulla grandezza della banda attesa e di quella che ti viene fuori.
Ti consiglio di diluire il DNA dei tuoi campioni e di fare delle prove su diluizioni scalari: considera che di materiale di partenza ne hai tantissimo e tantissimi sono gli acidi umici. Se diluisci anche questi ultimi saranno di meno!
A me col tal quale difficilmente venivano le PCR!!!
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Mar84
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2009 : 23:10:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mar84 Invia a Mar84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
altro che dimeri ragazzi!!!!
ho controllato bene la grandezza della banda con il ladder giusto ed é di circa 700-800bp ossia proprio come quella attesa..sigh sigh..non so proprio da dove iniziare se si tratta di una contaminazione ..mi scoraggia il fatto che in laboratorio lavorano altre persone senza nozioni minime di sterilitá ecc ecc..
la cosa che mi incuriosisce é che comunque nn tutti i campioni amplificano sará dovuto agli inibitori?
x mollichina..si sempre diluisco (o meglio solo quando faccio estrazioni con i kit ) e scelgo tra varie diluizioni
grazie a tutti siete, oltre che super preparati, gentilissimi (combinazione difficile da trovare a mio avviso)
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freddy1
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 11:15:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di freddy1 Invia a freddy1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
prova pwo H.Y. della roche e' molto...molto precisa e ricca di buffer con i quali modularti
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 11:54:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eh si a questo punto sembra proprio una contaminazione!
Dovresti controllare tutti i reagenti.
Ripeto non ho esperienza di campioni da suolo, ma se gli acidi umici possono inibire la PCR un motivo può essere quello, e nel controllo negativo è plausibile che tu abbia una contaminazione con quantità molto basse che quindi ti consentono l'amplificazione della banda.
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 19:48:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate ragazzi... sono d'accordo con voi sul fatto che la banda nel controllo negativo possa essere una contaminazione... ma in tal caso come spiegate il fatto che alcuni campioni nn hanno l'amplificato?

Se fosse colpa di una contaminazione l'amplificato sarebbe nel controllo negativo e in TUTTI i campioni!
Siete d'accordo?


Ascoltami con gli occhi...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 21:10:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Gst

Scusate ragazzi... sono d'accordo con voi sul fatto che la banda nel controllo negativo possa essere una contaminazione... ma in tal caso come spiegate il fatto che alcuni campioni nn hanno l'amplificato?

Se fosse colpa di una contaminazione l'amplificato sarebbe nel controllo negativo e in TUTTI i campioni!
Siete d'accordo?

Con la presenza di qualcosa che inibisca la PCR in alcuni campioni, come ad esempio gli acidi umici!
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Mar84
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 23:06:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mar84 Invia a Mar84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si anche io credo fosse dovuto agli inibitori...
comunque ho risolto il problema cambiando tutti i reagenti ..solo che la banda dell'amplificato é chiarissima....che potrei fare per avere rese maggiori di amplificato? Aumentare il numero di cicli? e se aumentassi anche di poco la concentrazione dei primer?
grazie
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 23:12:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Mar84

si anche io credo fosse dovuto agli inibitori...
comunque ho risolto il problema cambiando tutti i reagenti ..solo che la banda dell'amplificato é chiarissima....che potrei fare per avere rese maggiori di amplificato? Aumentare il numero di cicli? e se aumentassi anche di poco la concentrazione dei primer?
grazie

Beh nel link che ti avevo inviato dicevano appunto che con quella coppia di primers la banda di amplificato che si ottiene è molto debole!
Prova a fare entrambe le prove (separate), sia aumentare il numero di cicli che aumentare la concentrazione di primers.

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Mar84
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 23:22:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Mar84 Invia a Mar84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie!!!!!!!
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