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Autore Discussione  

Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi
Inserito il - 19 aprile 2006 : 10:22:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il mio messaggio è rivolto a tutti quei poveri ricercatori...costretti a lavorare con i batteri (che io personalmente non apprezzo, in quanto è dura passare dalle cellule eucariotiche ai batteri...ma a parte questo..)e con le proteine di fusione espresse nei batteri.
Discorsi a parte il succo é: vi è mai capitato di esprimere nei batteri proteine o meglio peptidi fusi all'ubiquitina e di trovar due bande (nel western blot) una corrispondente al tuo prod. di fusione e l'altra più bassa probabilmente corrispondente a prodotti di degradazione???
Il mio esprimento è stato: monitorare l'espressione della proteina fusa Ub-tatPEPTIDE nelle BL21DE3PLYS inducendo le cellule a 0.6 OD con 1mM IPTG. Come controlli ho usato il NON indotto che ho fatto crescere separatamente per 2 ore dopo gli 0,6 OD e le cellule non trasformate che ho fatto crescere nelle stesse identiche condizioni. Il tutto l'ho pellettato lisato solo con sds buffer, caricato su gel di poliacrilammide al 14%,trasferito su filtro e ibridato con anti-Ub.Il mio prodotto di fusione è di circa 14,3KDa.
dal western ho ottenuto negli indotti una banda sopra i 14,2Kda che però potrebbe essere il mio prod. e una banda sotto intorno ai 10.2 Kda. L'ub da sola pesa circa 8.4KDa. La stranezza sta nel fatto che questa sotto banda compare anche nel non indotto in cui però non si vede la banda più alta.....COME MAI?
Negl indotti potrebbero essere prod. di degr. ma nel non indotto che non ho un prod. basale... no!!!
Non è una proteina dei batteri perchè nelle cellule non trasformate non si vede!
Non è legato all'IPTG ma qualcosa legato al vettore, che negli indotti aumenta ma nel non indotto rimane costante al passare del tempo.
Se avete suggerimenti sono tutti ben accetti è già due volte che faccio questa prova e la banda ricompare...che cos'è???

Grazie a tutti

AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2006 : 00:34:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma esprimi nel citoplasma o nel periplasma?

ke ci sia del prodotto anke nel non indotto non mi sorprende + di tanto perkè mi capita spesso ke il pLac sia Leaky... + ke altro è il peso...
C'è qualke sito per proteasi fra ub e peptide?
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Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2006 : 01:04:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si c'è il sito per l'enterochinasi...ma nei batteri BL21DE3pLysS non ho teoricamente le proteasi.....comunque esprimo nel citoplasma!!Comunque nel non indotto c'è il prodotto a più basso pM che non corrisponde al mio!!
Grazie comunque della risposta sei stato l'unico..
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Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi
Inserito il - 21 aprile 2006 : 10:36:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate i comunque che ho inserito nella mia risposta...non si reggono!!!
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AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi
Inserito il - 24 aprile 2006 : 23:55:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
hai provato a mettere del glucosio nel tuo non indotto?
"stringendo" il pLac il prodotto a basso PM dovvrebbe sparire... alla fine se lo vede l'antiUb da lì dovrà venire no?
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Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi
Inserito il - 26 aprile 2006 : 13:14:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si si è vero...ma volevo rispondere al risultato senza alterare le caratteristiche di produzione...perchè a me sembrava strano vedere quel prodotto riconosciuto dall'anti-Ub ma di quel peso molecolare!!!!!
Cmq grazie
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