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Autore

Discussione

northenstar
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Citt�: Roma

91 Messaggi

Inserito il - 07 maggio 2010 : 14:10:29

Salve a tutti! avrei bisogno del vostro prezioso consiglio per risolvere un problema relativo ad un esperienza di laboratorio concernente il clonaggio genico.

Abbiamo trasformato una coltura di E.coli con il plasmide navetta pUG34 all'interno del quale � stato inserito un'inserto codificante per la proteina Sec 4 di lievito, dopo averlo digerito con EcoRI e BamHI.

Abbiamo poi piastrato la coltura trasformata su LB la coltura. Su Amp la nostra coltura presumibilmente trasformata e il controllo con solo il vettore.

Perch� piastrate su Ampicillina sia vettore+inserto che solo vettore? a che serve?

Studiando Biologia Molecolare con Matusalemme....

"Bisogna avere in s� il caos per partorire una stella che danzi." nietzsche

l�
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 07 maggio 2010 : 16:00:20

il controllo (solo il vettore) ti serve per vedere se la trasformazione � venuta, poi piastri la trasformazione del vettore+inserto perch� piccherai le colonie cresciute per fare una coltura in grande e successivamente purificare la tua proteina :-)

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 07 maggio 2010 : 16:10:13

se ti riferisci al solo vettore digerito � un controllo negativo che si fa per escludere la possibilit� di richiusura del vettore stesso.

Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 17 maggio 2010 : 15:47:04

Per escludere la possibilit� o anche semplicemente per valutare la percentuale (dal momento che perlomeno nella mia esperienza la probabilit� di richiusura del vettore c'� sempre ) di richiusura del vettore senza l'inserto. Quando fai una ligation tu metti a reagire il tuo vettore e il tuo inserto digerito con gli stessi enzimi. In teoria se hai effettuato la digestione con due enzimi differenti il vettore non si dovrebbe richiudere su stesso perch� le sue estremit� non sono compatibili. Ma pu� succedere ( e nella pratica succede il pi� delle volte ) che il vettore sia stato tagliato meglio con un enzima che con l'altro , ci� significa che una certa percentuale del tuo vettore � stato tagliato con un solo enzima e dunque con la ligation invece di incorporare il tuo inserto si richiuda su stesso. L'aggiunta di una piastra controllo ti permette di valutare con che percentuale si � verificato questo fenomeno. E questo ti � molto utile al momento dello screening ( per valutare il nuemro di colonie che dovresti esaminare per avere maggiori probabilit� di trovare un clone positivo ) ma anche per calcolare a priori la riuscita della ligation. Ad esempio se hai 100 colonie nella tua piastra con l'inserto ma 100 anche in quella senza l'inserto la cosa pi� probabile � che la ligation non sia riuscita e non ti conviene sprecare tempo ad effettuare lo screening dei cloni. Ma senza questo controllo non potresti saperlo.