chi mi sa dare un aiuto tempestivo? ho una serie di amplificati di 400 circa paia di basi . devo trovare una mutazione puntiforme utilizzando l'enzima HhaI . come faccio a riconoscere se l'ezima ha funzionato se non vedo nessun taglio (in particolare in quei campioni che non hanno la mutazione). posso utilizzare un ? insieme al campione da digerire in modo da avere la sicurezza della avvenuta digestione? grazie a tutti
dipende se la tua mutazione ti crea il sito di taglio o te lo cambia(enzima non lo riconosce).nel caso in cui la mutazione ti cambia il sito di restrizione si ha:se c'č la mutazione l'enzima non taglia quindi avrai,verificando il campione su gel di agarosio, una unica banda.se non c'č la mutazione allora l'enzima taglia e avrai cosi' due bande di cui devi sapere la lunghezza di basi(in base a che posizione lungo il pezzo di 400bp sta il sito mutato ossia il sito di restrizione.per essere certo usa un marker tipo marker IX che ti dice di quante coppie di basi sono le bande ottenute(naturalmente sarā una valutazione a occhio).nel caso che la mutazione ti crea il sito di restrizione sarā il contrario.spero di esserti stata utile. ciao e buon lavoro
In teoria se lavori in doppio o ancora meglio in triplo su ogni campione dovresti poter scartare l'ipotesi che la digestione non abbia funzionato e quindi scartare i falsi negativi.