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Badkarma
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
18 Messaggi |
 Inserito il - 12 agosto 2010 : 13:22:11
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Salve a tutti, visto che nella sezione biochimica non ricevo lumi provo a spostare qui il mio problema..sto purificando una proteina tramite FPLC a scambio ionico, già nelle frazioni eluite (da 1ml) noto la presenza di un aggregato biancastro sul fondo delle eppendorf...ho fatto una dialisi in tubi con cut-off da 10KDa per dializzare il solvente di eluizione che contiene sali e imidazolo contro pbs (dialisi overnight e cambio la mattina dopo per altre 5ore) ma anche nei tubi da dialisi noto sempre la presenza di aggregati...cosa posso utilizzare per cercare di solubilizzare questi aggregati? Starei inoltre cercando un composto che non sia DTT o urea, visto che poi la proteina la dovrei dosare su colture cellulari, e non vorrei questi agenti risultassero tossici per le colture..
grazie
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Nulla in biologia ha senso, se non ai fini dell'evoluzione.... |
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RNA world
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 14 agosto 2010 : 20:11:11
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se la proteina e' solubile e precipita durante la purificazione c'é qualcosa che non va.
1) a che temperatura purifichi?
2) potresti provare a usare anche del glicerolo (10%) nel buffer;
3) se usi urea le proteine si unfoldano, il che significa che poi devi trovare un modo per rifoldarle, ma è difficile;
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Badkarma
Nuovo Arrivato
Prov.: Padova
Città: Padova
18 Messaggi |
Inserito il - 16 agosto 2010 : 09:03:12
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purifico a T ambiente tramite FPLC AKTA BASIC 100 in colonne HiTrap da 5 ml caricata con NiCl2.
Il punto è che il precipitato che si forma non credo sia sale, perche tirato a secco e risospeso in LDS e caricato in gel e blottato + rivelato con anticorpi antiHIS-tag (la mia proteina ha un HIS-tag al C-ter) mi da una banda pulita e grossa, il che mi porta a pensare che sia effettivamente proteina quella cosa che precipita.. |
Nulla in biologia ha senso, se non ai fini dell'evoluzione.... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 agosto 2010 : 15:40:46
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Citazione:
Regolamento Forum
9) Non duplicare i messaggi, nè all'interno dello stesso forum, nè scrivendo lo stesso messaggio su più forum (cross-posting), perchè ciò rende molto difficile seguire una conversazione se piu persone rispondono allo stesso messaggio in diversi forum.
Se si è indecisi in quale sezione scrivere la propria domanda sceglierne una che sembri appropriata, i moderatori provvederanno a spostarla in caso lo ritengano necessario.
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In ogni caso cancello il doppione. |
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cianolu
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2010 : 11:33:15
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| forse dipende dal PH. Sei forse troppo vicino al punto isoelettrico della proteina che stai purificando? |
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proteina che aggrega
Didattica e Relazioni
