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Badkarma
Nuovo Arrivato


Prov.: Padova
Città: Padova


18 Messaggi

Inserito il - 12 agosto 2010 : 13:22:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Badkarma  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Badkarma Invia a Badkarma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, visto che nella sezione biochimica non ricevo lumi provo a spostare qui il mio problema..sto purificando una proteina tramite FPLC a scambio ionico, già nelle frazioni eluite (da 1ml) noto la presenza di un aggregato biancastro sul fondo delle eppendorf...ho fatto una dialisi in tubi con cut-off da 10KDa per dializzare il solvente di eluizione che contiene sali e imidazolo contro pbs (dialisi overnight e cambio la mattina dopo per altre 5ore) ma anche nei tubi da dialisi noto sempre la presenza di aggregati...cosa posso utilizzare per cercare di solubilizzare questi aggregati? Starei inoltre cercando un composto che non sia DTT o urea, visto che poi la proteina la dovrei dosare su colture cellulari, e non vorrei questi agenti risultassero tossici per le colture..
grazie

Nulla in biologia ha senso, se non ai fini dell'evoluzione....

RNA world
Utente Junior

dna



370 Messaggi

Inserito il - 14 agosto 2010 : 20:11:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RNA world Invia a RNA world un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se la proteina e' solubile e precipita durante la purificazione c'é qualcosa che non va.
1) a che temperatura purifichi?
2) potresti provare a usare anche del glicerolo (10%) nel buffer;
3) se usi urea le proteine si unfoldano, il che significa che poi devi trovare un modo per rifoldarle, ma è difficile;
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Badkarma
Nuovo Arrivato


Prov.: Padova
Città: Padova


18 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2010 : 09:03:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Badkarma  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Badkarma Invia a Badkarma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
purifico a T ambiente tramite FPLC AKTA BASIC 100 in colonne HiTrap da 5 ml caricata con NiCl2.
Il punto è che il precipitato che si forma non credo sia sale, perche tirato a secco e risospeso in LDS e caricato in gel e blottato + rivelato con anticorpi antiHIS-tag (la mia proteina ha un HIS-tag al C-ter) mi da una banda pulita e grossa, il che mi porta a pensare che sia effettivamente proteina quella cosa che precipita..

Nulla in biologia ha senso, se non ai fini dell'evoluzione....
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2010 : 15:40:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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9) Non duplicare i messaggi, nè all'interno dello stesso forum, nè scrivendo lo stesso messaggio su più forum (cross-posting), perchè ciò rende molto difficile seguire una conversazione se piu persone rispondono allo stesso messaggio in diversi forum.
Se si è indecisi in quale sezione scrivere la propria domanda sceglierne una che sembri appropriata, i moderatori provvederanno a spostarla in caso lo ritengano necessario.
Tutti i messaggi doppi verranno cancellati.


Se credi che un'altra sessione sia più adatta alla tua domanda chiedi ad un moderatore di quella sessione di spostartela, anche se il fatto di non ricevere risposte in genere non dipende dalla sezione, ma bisogna pazientare e attendere che qualcuno che sappia rispondere legga la tua domanda e intervenga.
In ogni caso cancello il doppione.
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cianolu
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 06 settembre 2010 : 11:33:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cianolu Invia a cianolu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
forse dipende dal PH. Sei forse troppo vicino al punto isoelettrico della proteina che stai purificando?
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