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talpa24000
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2010 : 20:13:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!!
Ho appena provato a mettere appunto una pcr in cui utilizzo una coppia di primers specifici per una sequenza genica presente a livello del cDna di un batterio. il tracciato elettroforetico è "pulito" nel senso che non vi è la presenza di bande aspecifiche. L'unico problema è che i prodotti attesi dovrebbero essere intorno ai 920 bp, mentre quelli che ottengo io sono ben definiti ma un pochino sopra ai 1000 bp (compreso il controllo positivo). Che ne pensate?? A me pare strano che siano aspecifici...
grazie mille!!!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2010 : 21:42:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sei sicuro di riuscire a distinguere 1000 bp e 920 (o magari qualcosa di +, a seconda di come hai disegnato i primers) sul tuo gel?

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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2010 : 21:43:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
metti la foto del gel se ti è possibile, nome del gene e specie del batterio :)


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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2010 : 21:44:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mettici pure la sequenza dei primers cosi' facciamo prima


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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2010 : 21:45:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
... e controlla anche che il ladder sia affidabile

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 00:20:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

... e controlla anche che il ladder sia affidabile


concordo! Magari prova ad utilizzare anche un altro ladder e assicurati che sia quello il peso della banda.

Altrimenti per assicurati che siano specifici se hai il dubbio potresti farci una nested.
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 00:34:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
o se hai un sito di restrizione utile taglia l amplificato cosi' non aspetti che ti arrivino i primers per la nested


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 00:47:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio

o se hai un sito di restrizione utile taglia l amplificato cosi' non aspetti che ti arrivino i primers per la nested


Se hai un sito di restrizione giusto e non c'è lo stesso nell'ipotetico aspecifico e hai già l'enzima giusto... in genere ci mettono molto poco a sintetizzare i primers e inviarli.

In ogni caso come prima cosa io ricontrollerei la lunghezza dell'amplificato atteso con quei primers e utilizzerei un altro ladder.
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 00:52:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
da me 3 giorni con un basso prezzo


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talpa24000
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 17:59:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...premetto che per adesso sto utilizzando dei ladders 100 bp in uso nel laboratorio accanto in cui analizzano maggiormente amplificati molto più piccoli, intorno ai 300 bp. Ad ogni modo,la prima volta ho fatto il gel all'1,5% e le bande dei markers che mi interessavano per leggere i 920 bp si erano separate così e così, poi per ovviare a questo problema ho fatto il gel all'1% e le bande dei markers di mio interesse si sono separate un pò meglio...l'altezza dei miei amplificati sembra proprio essere superiore ai 920 bp, sopra i 1000 bp, almeno in base alle bande di questo marker. Cmq in lab abbiamo un altro ladder 100 bp, che proverò sicuramente. La coppia di primers che ho utilizzato è presa da un lavoro, io ho variato un pò le concentrazioni dei reagenti e il protocollo di amplificazione...Secondo voi può cmq succedere che le dimensioni degli amplificati possano variare un pochino da quelle scritte in un lavoro?? Appena possibile vi farò avere le altre informazioni e la foto del gel...
per adesso grazie mille, siete stati gentilissimi!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 13 dicembre 2010 : 23:20:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da talpa24000

La coppia di primers che ho utilizzato è presa da un lavoro, io ho variato un pò le concentrazioni dei reagenti e il protocollo di amplificazione...Secondo voi può cmq succedere che le dimensioni degli amplificati possano variare un pochino da quelle scritte in un lavoro??


Quindi tu non hai controllato dove si legano i primers sulla tua sequenza da database e quanto è il frammento amplificato? Quella sarebbe la prima cosa da fare.
Non è affatto detto che dei primers pubblicati in un lavoro siano buoni, possono essere buoni, come no, sempre meglio controllare.
Il batterio che utilizzi è lo stesso del lavoro da cui hai preso i primers?
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talpa24000
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2010 : 23:38:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...Sicuramente il sequenziamento sarebbe la soluzione migliore senza ombra di dubbio, ma adesso in lab avremo qualche difficoltà ad effettuarlo ...Cmq Il Dna batterico che utilizzo è lo stesso del lavoro e purtroppo è vero che le sequenze di primers riportate in un lavoro non rappresentano sempre e cmq una garanzia...L'unica cosa che mi lascia perplessa (e che mi rincuora anche un pò!!) è che il tracciato elettroforetico sembra essere abbastanza chiaro: i negativi sono pulitissimi, il controllo positivo è netto e senza aspecifici e i campioni positivi sono altrettanto netti...



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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 13 dicembre 2010 : 23:47:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da talpa24000

...Sicuramente il sequenziamento sarebbe la soluzione migliore senza ombra di dubbio, ma adesso in lab avremo qualche difficoltà ad effettuarlo ...

ma chi ha parlato di sequenziamento?
Sicuramente quello ti toglierebbe ogni dubbio sulla specificità del prodotto, ma non sempre effettuarlo può essere semplicissimo sopratutto se non si ha un sequenziatore.
Comunque quello che dicevo io è:
- andare in database e prendere la sequenza di quel gene del DNA del batterio in questione
- prendere i primers e vedere dove si legano
- vedere la lunghezza dell'amplificato
tutte cose che si fanno semplicemente con un PC
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mak_steon
Utente Junior



138 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2010 : 09:59:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mak_steon Invia a mak_steon un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
- andare in database e prendere la sequenza di quel gene del DNA del batterio in questione
- prendere i primers e vedere dove si legano
- vedere la lunghezza dell'amplificato
tutte cose che si fanno semplicemente con un PC


Quoto tutto

Un'altra cosa:
Ma il positivo dove lo hai preso?
Ti viene alla stessa altezza dei tuoi campioni o un pò più basso?
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talpa24000
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7 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2010 : 17:58:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...oddio scusa non avevo letto bene...si, sono andata su primer Blast, ho inserito la sequenza dei primers e il nome del germe e innanzitutto ho visto che il mio amplificato dovrebbe essere di 968 bp e non 920 bp, poi purtroppo ho visto che i primers danno origine a diversi amplificati anche sui 1000-1100 bp:

product length = 968
Features associated with this product:
beta-galactosidase

Forward primer 1 CACTATGCTCAGAATACA 18
Template 1273793 .................. 1273776

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template 1272826 .................. 1272843


product length = 1044
Features associated with this product:
phosphopantothenate--cysteine ligase

formate--tetrahydrofolate ligase

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template 764639 TTG..TT.......T... 764622

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template 763596 GA.......AGT...A.. 763613



product length = 1187
Features associated with this product:
hypothetical protein

Forward primer 1 CACTATGCTCAGAATACA 18
Template 1116103 .TT........T....A. 1116120

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template 1117289 GTT...A.C........G 1117272

...Cmq dato che non sono molto pratica di questo programma, potreste verificare sul programma se ho inserito i dati in modo corretto??
primer forward: cactatgctcagaataca
primer reverse: cgaacagcattgatgtta
il germe è Streptococcus thermophilus

P.S. Sull'amplificato di 1044 bp, sono riportate le sequenze del reverse 2 volte...che significa??

Grazie ancora per la vostra immensa disponibilità!!
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talpa24000
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2010 : 18:01:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dimenticavo...si, il controllo positivo è alla stessa altezza dei campioni positivi...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2010 : 23:02:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io forse ho utilizzato un database differente perché ho risultati leggermente diversi, comunque:
- l'amplificato specifico in ogni caso è di 968bp
- gli aspecifici ci potrebbero essere ma non sono molto favoriti, comunque hai vari mismatch nell'appaiamento dei primers, ad es.:
product length = 1044
Features associated with this product:
phosphopantothenate--cysteine ligase

formate--tetrahydrofolate ligase

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template  764639 TTG..TT.......T... 764622

Reverse primer 1 CGAACAGCATTGATGTTA 18
Template  763596 GA.......AGT...A.. 763613

ovviamente sono peggio i mismatch al 3'

Il fatto che in questo caso sia segnato 2 volte il reverse è perchè è solo quello che si lega, in 2 punti diversi e funge sia da For che dà Rev dando un amplificato, non penso che tu abbia questo aspecifico, ma per controllere ci vorrebbe pochissimo, basta che tu faccia la PCR solo col reverse e se ti viene fuori la banda può essere quello, anche se sinceramente lo escluderei.

Prova con altri standard di peso molecolare, magari prova ad usare anche un marker oltre al ladder e confrontali.

Siccome mi aspetto la domanda:
- ladder: hanno in genere bande a PM precisi multipli ad es. 100bp: 100 - 200 - 300 - 400 - 500 - 600 - 700 - 800 - 900 - 10000
- marker: sono bande con PM "specifici" non uno multiplo dell'altro ad es.: 125 - 348 - 926 - 1080 - 1123
esistono anche ladder un po' "ibridi", hanno bande specifiche e nette ma non hanno tutti i multipli ad es.: 50 - 100 - 200 - 400 - 600 - 1000 - 1500
a volte avere una banda netta è di più facile lettura che non avere bande tutte ammassate.

Non per fare pubblicità (tant'è che io ne uso altri) ma Fermentas ne ha un'infinità, giusto per farti un'idea: http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis
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talpa24000
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 14 dicembre 2010 : 23:35:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di talpa24000 Invia a talpa24000 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...Hai proprio ragione!!!
Nell'altro lab dove stavo prima utilizzavo "gli ibridi" di cui parli tu e andavano benissimo...per adesso purtroppo mi hanno detto che devo accontentarmi dei ladder in uso, cmq appena sarà possibile lo sostituirò di sicuro...
Domani farò cmq una corsa con altri campioni utilizzando un altro ladder (che ancora non ho provato ma che non credo sia così diverso dall'altro). Se dovessi avere altri dubbi farò la PCR solo con il Reverse, come mi hai giustamente consigliato tu...
Sei stata davvero troppo gentile e soprattutto chiarissima!!
GRAZIE MILLE
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