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Dionysos
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***********MOLECULAR LAB's OFFICIAL JOURNAL CLUB***************


First Edition - 2011, March 23


TITOLO: The Lkb1 metabolic sensor mantains haematopoietic stem cell survival

GIORNALE: Nature - ISSN 0028-0836, Nature Publishing Group, www.nature.com

PUBBLICATO ONLINE : 1 dicembre 2010 - doi:10.1038/nature09572

AUTORI:
Sushma Gurumurthy, Stephanie Z. Xie , Brinda Alagesan, Judith Kim, Rushdia Z. Yusuf, Borja Saez, Alexandros Tzatsos, Fatih Ozsolak, Patrice Milos, Francesco Ferrari, Peter J. Park, Orian S. Shirihai, David T. Scadden & Nabeel Bardeesy

ABSTRACT :
Haematopoietic stem cells (HSCs) can convert between growth states that have marked differences in bioenergetic needs. Although often quiescent in adults, these cells become proliferative upon physiological demand. Balancing HSC energetics in response to nutrient availability and growth state is poorly understood, yet essential for the dynamism of the haematopoietic system. Here we show that the Lkb1 tumour suppressor is critical for the maintenance of energy homeostasis in haematopoietic cells. Lkb1 inactivation in adult mice causes loss of HSC quiescence followed by rapid depletion of all haematopoietic subpopulations. Lkb1-deficient bone marrow cells exhibit mitochondrial defects, alterations in lipid and nucleotide metabolism, and depletion of cellular ATP. The haematopoietic effects are largely independent of Lkb1 regulation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signalling. Instead, these data define a central role for Lkb1 in restricting HSC entry into cell cycle and in broadly maintaining energy homeostasis in haematopoietic cells through a novel metabolic checkpoint.

link al lavoro originale

link al lavoro FREE su Pubmed

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(F.W. Nietzsche)

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Dionysos
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BACKGROUND E RAZIONALE DEL LAVORO:

Questo lavoro si propone di indagare un nuovo aspetto della biologia delle cellule staminali ematopoietiche

Il lavoro prende spunto dalla forte e ben documentata connessione esistente tra regolazione
dell' entrata nel ciclo cellulare
e sopravvivenza a lungo termine nelle cellule staminali
ematopoietiche (HSC, haematopoietic stem cells) introducendo in questa relazione biunivoca
un cruciale elemento di grande novità, finora poco indagato a livello di queste cellule:
il ruolo del metabolismo cellulare

Gli autori introducono nel campo della staminali questo elemento inedito,
verificando se:
Il gene Lkb1, un gene oncosoppressore (=un gene che regola la crescita cellulare )
al tempo stesso attivatore bioenergetico (= un gene che regola il metabolismo cellulare)
sia oppure no importante nel mantenere l'omeostasi di questo genere di cellule staminali .


GLI AUTORI DICHIARANO:

Le affermazioni ("claims") pronunciate dagli autori
sono, in brevissima, che:

1) Lkb1 sarebbe un gene critico per le HSC, quindi la sua espressione sarebbe
strettamente necessaria per il mantenimento
in vivo di questo tipo di cellule staminali

2) La suddetta importanza di Lkb1 deriverebbe da una necessità
intrinseca
di Lkb1 da parte delle HSC stesse.
(->"fenotipo cell-autonomo")

3) In termini di meccanismo: Lkb1 garantirebbe il mantenimento
delle HSC regolando la quiescenza delle stesse , in qualità di oncosoppressore


4) Oltre a ciò: Lkb1 manterrebbe la sopravvivenza di HSC e progenie preservandole
da morte per apoptosi indotta da possibile deprivazione di nutrienti bioenergetici /
possibile stress ossidativo / possibile genotossicità a carico di HSC e progenie


5) Degno di nota: nessuna connessione diretta tra questo fenotipo
e l'attività di mTOR (ben noto "master regulator" delle funzioni
biologiche delle HSC) o di AMPK (importante fattore a valle di
Lkb1) sarebbe stata trovata dagli autori, i quali suggeriscono
l'esistenza di un meccanismo alternativo e indipendente da essi


5) La funzione di Lkb1 nelle HSC consisterebbe nel mantenere
un metabolismo ossidativo mitocondriale (produzione ATP) bilanciato
tra anabolismo e catabolismo cellulare "in qualità di sensore metabolico"




Di seguito saranno elencate le figure del lavoro
a titolo di prova e di sostegno a queste affermazioni.




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Dionysos
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Inserito il - 23 marzo 2011 : 05:15:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Indicazioni di carattere generale su questa edizione del JC

- In questo thread sarà data la possibilità di discutere
qualsiasi punto di questo articolo in qualsiasi momento.

-Per cercare di sostenere la discussione, le figure verranno
presentate e commentate dal sottoscritto con una certa cadenza:
questo servirà per definire una traccia nella discussione

-Tuttavia, essendo questo un forum (e non un'esposizione powerpoint)
ciascuno potrà dire la sua su qualsiasi punto o questione dell'articolo
ed in qualsiasi momento, in piena libertà, ma ad una precisa condizione:
utilizzare sempre lo strumento QUOTE per evitare confusioni
e permettere di condurre una discussione ordinata.


I punto di discussione del Journal club saranno:

Ritenete questi esperimenti chiari ed esaustivi?

Ritenete che vi sia una perfetta coerenza tra questi dati ?

Soprattutto : Giudicate che i dati nelle figure supportino queste affermazioni ?

Avreste fatto lo stesso ? Quali altri esperimenti avreste fatto?

Cosa ritenete che manchi in questo lavoro ?

Detto ciò:
Che la discussione abbia inizio!!

Come "chairman" mi metto a disposizione per chiarire qualsiasi
dubbio tecnico riguardante materiali& metodi e ragioni tecniche
degli esperimenti (nei limiti delle mie conoscenze, chiaramente).

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Dionysos
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Inserito il - 23 marzo 2011 : 05:49:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
1) Lkb1 sarebbe un gene critico per le HSC, quindi la sua espressione sarebbe
strettamente necessaria per il mantenimento in vivo di questo tipo di cellule staminali



FIGURA 1
(liberamente tratta da PubMed)



Sono raffigurati dati provenienti da topi knock-out condizionali/inducibili
per l'espressione di Lkb1: la somministrazione di un agonista interferonico
(pIpC) induce il knock-out facendo partire l'espressione della recombinasi
Cre in un background floxato (LoxP) per Lkb1. Il promotore che esprime la
Cre è un promotore responsivo all'interferone, attivo in tutti i tessuti (!!!)

Il farmaco è stato somministrato "every second day over 7 days"


Legenda figure:

a) Curva di sopravvivenza di 10 topi knock-out condizionali per Lkb1
(immagino sia una curva di tipo "Kaplan-Meier")

b) "Cellularità" (numero assoluto di cellule mononucleate) nel midollo osseo di 4 topi
knockout condizionali per Lkb1 nel corso dell'induzione del knock-out (notare bene!)


c) Conta assoluta (al giorno 5 rispetto alle timeline precedenti)
di diversi tipi di cellule del sangue periferico dei
suddetti topi rispetto a controlli:
- Globuli bianchi totali (WBM)
- Linfociti (LYM)
- Neutrofili (NEU)
- Globuli rossi (RBC)
- Piastrine (Platelets)

d) Rappresentazione percentuale (sempre al giorno 5, stessi topi
contro stessi controlli) delle tipologie cellulari nel midollo
definite da antigeni di superficie:
- Cellule mieloidi (Gr-1+)
- Cellule B (B220+)
- Cellule eritroidi (Ter-119+)

e) Conta assoluta (!!!?) del numero di HSC nel midollo
osseo dei suddetti topi, al suddetto time point

f) Conta assoluta (nuovamente: !!!?) del numero
di progenitori committed/oligopotenti, progenie delle HSC:

- Progenitori comuni linfoidi (CLP)
- Progenitori comuni mieloidi (CMP)
- Progenitori granulocitici/monocitici (GMP)
- Progenitori megacariocitici/eritrocitici (MEP)

g) Saggio funzionale di differenziamento (formazione di
colonie clonogeniche attraverso colture in terreno semisolido, in
questo caso metilcellulosa) indicante la conta di unità formanti
colonie
, ovvero unità funzionalmente definite.

CFU-GEMM = unità formanti colonie di tutte le linee
CFU-GM = unità formanti colonie di linea granulocitica/monocitica
CFU-M = unità formanti colonie di macrofagi
CFU-G = unità formanti colonie di granulociti
BFU-E = unità formanti "burst" eritroidi (ammassi di globuli rossi)

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 23 marzo 2011 : 19:20:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho finalmente preso un po' di tempo per leggermi bene il paper.

Come commento generale direi che è un paper molto solido (certo, non sono esattamente del campo, ma non vedo flaws evidenti da nessuna parte).

Sono stato particolarmente colpito dal fatto che gli autori si siano sbattuti (e non poco immagino) a fare gli esperimenti sia sugli Mx1-cre che sui ROSA26-creERt2.

Per quanto riguarda la Fig 1 nello specifico, direi che fa sempre invidia vedere risultati del genere...

Una cosa che mi chiedo da completo ignorante in materia: perchè la conta dei globuli rossi non diminuisce (Fig 1C) ma quella dei MEP sì (Fig 1F)?

Inoltre non mi sembra che commentino sulle differenti proporzioni di CFU nella figura G, che sembrano essere diverse nei due casi (tra l'altro odio quei grafici stacked, sono di difficile interpretazione e bassa leggibilità).

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


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Inserito il - 23 marzo 2011 : 20:24:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il punto sui globuli rossi è importantissimo, anche da un punto di vista clinico.

Si riflette sia a livello funzionale (nelle CFU, che - per l'appunto -
non commentano) che a livello di cellularità eritroide e di MEP.

Qualcuno vuole provare a commentare?

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2011 : 16:48:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
FIGURA 2
(liberamente tratta da PubMed)




Sono raffigurati dati provenienti da topi TRAPIANTATI (trapianto di
midollo osseo tradizionale, di genere non competitivo) con CELLULE
del midollo osseo provenienti dai topi mutanti del precedente esperimento.

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AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2011 : 16:56:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80


Sono stato particolarmente colpito dal fatto che gli autori si siano sbattuti (e non poco immagino) a fare gli esperimenti sia sugli Mx1-cre che sui ROSA26-creERt2.




probabilmente una richiesta del famoso 3º reviewer (che in questo specifico caso potrebbe altri non essere che il [ex]capo di Dionysos).

Perche' alcuni autori sono in grassetto? Son + fighi?

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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


421 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 02:52:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80



Una cosa che mi chiedo da completo ignorante in materia: perchè la conta dei globuli rossi non diminuisce (Fig 1C) ma quella dei MEP sì (Fig 1F)?




Magari dico una boiata, ma a me sembra che tutte le linee cellulari che poi daranno eritrociti risentono in maniera minore, rispetto alle altre, della mancanza di lkb1. Anche i gradi di apoptosi sono più bassi per le MEP. A questo punto cosa si potrebbe fare per vedere attraverso quale via agisce nelle HSC? Che ne dite di un analisi di trascrittomica in cellule con lkb1 overespresso?

"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 09:05:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vero, il grado di apoptosi è più basso, ma comunque diventano ~1/3 (a occhio), mentre gli eritrociti restano praticamente invariati.
Tuttavia, in effetti, siccome dai MEP originano sia i megacariociti che gli eritrociti, e gli eritrociti sono invariati, si può supporre che i megacariociti diminuiscano. Non so perchè non abbiano misurato i megacariociti direttamente ma in effetti le piastrine (che derivano dai megacariociti) diminuiscono di 6-7 volte.
Quindi immagino che ci sia una spinta verso la linea eritroide piuttosto che verso la linea megacariocitica... ma perchè? C'è una ragione fisiologica o, come diceva zerhos semplicemente la linea eritroide è controllata da altri fattori?

Citazione:
A questo punto cosa si potrebbe fare per vedere attraverso quale via agisce nelle HSC? Che ne dite di un analisi di trascrittomica in cellule con lkb1 overespresso?

Io prima di gettarmi in analisi di trascrittomica ragionerei sulle conte cellulari in quel caso. Cosa succederebbe overesprimendo Lkb1? Gli eritrociti rimarrebbero stabili e le piastrine aumenterebbero???


@aleXo: ho pensato anche io al famoso 3º reviewer però... va bene tutto ma devi essere proprio bast**** dentro per chiedere una cosa del genere! Ma non divaghiamo.


PS: interessante immagine trovata su Wikipedia (sorry, non l'ho trovata in italiano o in inglese, ma si capisce lo stesso)



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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 11:40:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Meno male che c'è il week-end, così posso leggere con calma il lavoro :D
Citazione:

Vero, il grado di apoptosi è più basso, ma comunque diventano ~1/3 (a occhio), mentre gli eritrociti restano praticamente invariati.
Tuttavia, in effetti, siccome dai MEP originano sia i megacariociti che gli eritrociti, e gli eritrociti sono invariati, si può supporre che i megacariociti diminuiscano. Non so perchè non abbiano misurato i megacariociti direttamente ma in effetti le piastrine (che derivano dai megacariociti) diminuiscono di 6-7 volte.
Quindi immagino che ci sia una spinta verso la linea eritroide piuttosto che verso la linea megacariocitica... ma perchè? C'è una ragione fisiologica o, come diceva zerhos semplicemente la linea eritroide è controllata da altri fattori?



Dico anch'io la mia boiata a riguardo:
Lkb1 è un gene che regola il metabolismo, quindi nelle MEP (che hanno un attivo metabolismo) si vede la differenza perchè manca questo gene, invece i GR non mi pare di ricordare che hanno tutto questo metabolismo attivato...non hanno nucleo, non hanno mRna, non hanno sintesi proteica (verosimilmente hanno già fatto tutto questo). Quindi le MEP che riescono a diventare GR poi non risentono più della mancanza del gene perchè non fanno tanto metabolismo.
Può essere?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


421 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 14:24:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Immagine:

208,47 KB

a quanto pare questo gene si esprime poco nelle linee eritroidi, magari è per questo che gli effetti del knockout sono meno visibili.


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Salvador.Dalì
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 15:18:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ammetto di non aver avuto ancora tempo di leggere l'articolo, però leggendo semplicemente i commenti qui mi è venuta in mente una considerazione mooooolto banale, riguardo a questo:

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Una cosa che mi chiedo da completo ignorante in materia: perchè la conta dei globuli rossi non diminuisce (Fig 1C) ma quella dei MEP sì (Fig 1F)?


a me il motivo più plausibile sembrerebbe la differenza di "vita media" dei vari tipi cellulari:
Eritrociti - 120 giorni
Piastrine - 10 giorni
Granulociti e monociti - 10 ore
Linfociti (qua dipende dal tipo) - da pochi giorni a qualche mese

se non ho capito male, la conta cellulare è stata fatta 5 giorni dopo l'induzione del KO (ripeto, non ho letto l'articolo per intero) e la cosa che mi viene in mente è appunto che i MEP possono essere diminuiti ma gli eritrociti non ancora perché quelli formati non hanno avuto ancora il tempo di essere completamente eliminati.

Poi anche le altre considerazioni che sono state fatte possono essere valide, ma molto a occhio questo mi sembrerebbe il motivo principale.
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Martin.diagnostica
Utente Attivo

H. pylori



1582 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2011 : 01:40:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Martin.diagnostica Invia a Martin.diagnostica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Citazione:Messaggio inserito da chick80

Una cosa che mi chiedo da completo ignorante in materia: perchè la conta dei globuli rossi non diminuisce (Fig 1C) ma quella dei MEP sì (Fig 1F)?

a me il motivo più plausibile sembrerebbe la differenza di "vita media" dei vari tipi cellulari:

Assolutamente questa è la spiegazione infatti le persone che hanno subito una trasfusione di sangue presentano un'alterata distribuzione dei volumi delle RBCs per diverse settimane a causa della longevità dei globuli rossi. Per capirci invece di una curva a campana presentano una distribuzione bimodale, con la comparsa del nuovo valore di moda corrispondente a quello del donatore






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