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Edoardo Cherubini
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 19 settembre 2011 : 14:22:33
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Salve a tutti, è possibile costruire primer ad RNA per la PCR?
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 11:47:49
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Anch'io sarei interessato alla cosa..credete che si possano usare primer di RNA almeno a livello teorico? In fondo la DNA-polimerasi usa proprio l'RNA come primer in vivo..  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 14:24:15
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| bella domanda, non saprei... piu' che altro mi domando quanto possano essere stabili questi ipotetici primer di RNA e resistere a diversi cicli di congelamento/scongelamento... |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 15:12:36
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| Infatti pensavo anch'io che il limite principale sarebbe la stabilità, e forse anche ormai la facilità di avere a disposizione primer di DNA rispetto che a RNA. Però forse dal punto di vista teorico non ci sarebbero grossi limiti.. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 15:23:05
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| non solo, ma poi metti che devi includere in questi primer dei siti di restrizione... le endonucleasi di restrizione non taglierebbero queste sequenze (che poi ad ogni ciclo di pcr le sequenze complementari del primer non verrebbero nemmeno copiate dalla polimerasi sul filamento opposto, essendo la taq una DNA-polimerasi DNA-dependente) |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 15:34:44
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Ma essere polimerasi DNA-dipendente non dipendeva dal fatto che usava uno stampo di DNA per la sua attività? Cioè a prescindere dal primer usato come "-OH" d'innesco. Ma in ogni caso il problema degli enzimi di restrizione rimarrebbe se poi con gli amplificati ci volessimo fare qualcosa  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 15:47:16
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Citazione:
Messaggio inserito da Geeko
Ma essere polimerasi DNA-dipendente non dipendeva dal fatto che usava uno stampo di DNA per la sua attività? Cioè a prescindere dal primer usato come "-OH" d'innesco. Ma in ogni caso il problema degli enzimi di restrizione rimarrebbe se poi con gli amplificati ci volessimo fare qualcosa
Infatti mi riferisco proprio a quello, ma forse non mi sono fatto capire: nel momento in cui la polimerasi arriva "sotto" il primer (cioè trascrive la sequenza inversa e complementare al primer stesso) non lo puo' fare perchè il primer è di RNA. Ti torna il discorso? |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 16:13:45
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Certo, hai ragione, il problema non è all'innesco, ma una volta che la poli arriva duplicare l'estremità col primer, giusto.  |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2011 : 20:22:52
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Ma quale sarebbe lo scopo? Perchè fare una PCR con primers di RNA?
Comunque la cosa è possibile, ma non con una Taq!
Come diceva giustamente Spemann il problema è che la Taq (e in genere le DNA-polimerasi) non e in grado di sintetizzare DNA da uno stampo di RNA, quindi la reazione si bloccherebbe. Però c'è un enzima in grado di fare ciò, ovvero la "retrotrascrittasi", utilizzando quindi enzimi che abbiamo sia la funzione di DNA-polimerasi che quella di retrotrasmcrittasi è possibile farlo.
Sinceramente io non ci vedo alcun vantaggio però.
Comunque vi consiglio quest'articolo: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8750199 |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2011 : 10:27:28
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Credo fosse una domanda d'esame..
Grazie per gli interventi ragazzi! Almeno s'è fatta un po' di chiarezza.  |
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Edoardo Cherubini
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2011 : 10:56:18
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| Ringrazio tutti di aver risposto al mio quesito, siete stati gentilissimi, vi ho posto questa domanda perchè avevo in un compito di esame universitario un esercizio che riguardava la costruzione di due primer per PCR, io li ho costruiti ad RNA invece che a DNA. Dopo aver svolto il compito mi sono ricordato che i primer per PCR sono a DNA non ad RNA e quindi sono finito in panico. Speriamo che il professore mi consideri almeno qualche punto. Ringrazio di nuovo tutti siete stati molto gentili. Edoardo. |
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