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Giuditta
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 13 giugno 2013 : 11:15:24
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Ciao ragazzi, avrei un problemino da sottoporvi.
Devo clonare un vettore per lentivirus ma il clonaggio mi sta dando tante gatte da pelare.
Il vettore è il pWPI-BLR che è lungo 10kb. E' il vettore più grande con cui abbia lavorato 
L'inserto è lungo 2.5kb. Insomma...lavoro con numeri grossi e temo sia questo il problema principale.
In più l'inserto è frutto di una PCR nei cui primer ho inserito io i siti di restrizione alle estremità...per forza di cose si tratta sempre di pacI, con il quale ho linearizzato il vettore. In questo modo l'inserto si inserirà sia correttamente che invertito ma non ho potuto fare diversamente, questo vettore ha pochissimi siti utili :S
Sono partita defosforilando il vettore ma la resa della trasformazione era bassissima. Ho quindi optato per non defosforilare e mi sono rassegnata a screenare moltissime colonie. Ma risultano tutte negative, il vettore si richiude da solo.
Considerate le notevoli dimensioni di vettore e inserto, quale sarebbero le condizioni migliori in termini di rapporto tra i due?
Grazie dell'aiuto! 
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2013 : 15:40:21
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Ciao
Sarebbe meglio fornire maggiori informazioni es. tempo di digestione/defosforilazione, quantità di ligasi, temperatura/tempo di ligazione e quantità di vettore.
Tutto ciò assumendo che gli enzimi (ligasi e CIP) funzionino; inoltre do per scontato che tu stia usando primers di clonaggio da digerire con basi extra al 5' (in genere io uso tre G); che metodo usi per lo screening? se usi colony pcr per screenare è importante usare una coppia di primers in cui uno si leghi necessariamente al vettore (non entrambi sull' inserto).
Per vettori di grandi dimensioni comunque io ho avuto buoni risultati utilizzando poco DNA (20-30 ng) e inserto in rapporto vettore:inserto 1:3
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Giuditta
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2013 : 16:04:31
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La digestione di vettore e inserto la faccio anche O/N. La defosforilazione avviene in 30' massimo un'ora (non ho sotto mano il quaderno ora)
Per la ligazione uso un volume di 10ul di cui 1/10 è ligasi, ligazione fatta a temperatura ambiente e in non meno di un'ora, arrivo anche a 4 ore se il tempo permette.
Per lo screening faccio semplice digestione con una coppia di enzimi, uno taglia dentro l'inserto e uno fuori e in base alla lunghezza dei frammenti discrimino facilmente se l'inserimento è corretto o invertito...se vedessi frammenti! Per ora solo il linearizzato che proviene dal vettore richiuso.
Il primer for ha come basi extra al 5' cgc mentre al rev abbiamo catc.
Purtroppo non so come controllare se l'inserto è effettivamente digerito
 ma pacI è un buon enzima. |
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2013 : 18:31:16
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Faccio clonaggi del genere di continuo e non ho mai avuto grossi problemi, vediamo se ti può essere utile:
- Ligasi t4 della proomega, ligation OBBLIGATORIAMENTE o/N a 4 gradi!;
- CIP della NEB, in genere digerisco 4-5 ug di vettore, aggiungo quindi 2-2,5 ul di CIP per MINIMO un'ora, massimo un'ora e mezza.
- Rapporti, nel 90% dei casi uso 1:3, ma funziona bene anche 1:5 (generalmente quando il vettore è molto molto grande e l'inserto è molto molto piccolo), la quantità di vettore con cui lavoro è sempre 50-80ng, mai oltre.
Personalmente ho grossi problemi a digerire direttamente dal prodotto di PCR, il più delle volte arrivo in fondo con la piastra completamente vuota (anche se aggiungo 3-5 basi alle estremità...), preferisco sempre fare un passaggio di T/A cloning. è più lungo, ma si ha la certezza di arrivare in fondo con qualcosa. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Giuditta
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2013 : 11:00:52
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Grazie, siete tutti molto gentili.
Penso che proverò con la ligazione a 4°C O/N, da noi non si usa ma in genere non abbiamo problemi con quella a RT, i problemi nascono quando abbiamo grossi inserti.
Zerthos, ti chiedo un paio di chiarimenti:
- dici che usi rapporto 1:5 quando "il vettore è molto molto grande e l'inserto è molto molto piccolo". Intenti piccolo in termini assoluti o piccolo in rapporto al vettore? Nel mio caso l'inserto è 1/4 del vettore e nessuno dei due è piccolo. Conviene aumentare la quantità di inserto?
- cosa è T/A cloning? |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2013 : 18:08:26
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Citazione:
Messaggio inserito da Giuditta
Grazie, siete tutti molto gentili.
Penso che proverò con la ligazione a 4°C O/N, da noi non si usa ma in genere non abbiamo problemi con quella a RT, i problemi nascono quando abbiamo grossi inserti.
Zerthos, ti chiedo un paio di chiarimenti:
- dici che usi rapporto 1:5 quando "il vettore è molto molto grande e l'inserto è molto molto piccolo". Intenti piccolo in termini assoluti o piccolo in rapporto al vettore? Nel mio caso l'inserto è 1/4 del vettore e nessuno dei due è piccolo. Conviene aumentare la quantità di inserto?
- cosa è T/A cloning?
Lo intendo in rapporto al vettore, ad esempio se hai frammenti da 3-500 bp che vanno clonati in un vettore di 7-15kb, mentre nel tuo caso va benissimo il rapporto 1/3.
Il T/A cloning è una tecnica di clonaggio "veloce", che sfrutta una caratteristica di alcune polimerasi utilizzate per PCR. Queste polimerasi tendono ad aggiungete alle estremità 5' dei frammenti amplificati una A, in questo modo puoi ligare direttamente il tuo prodotto di PCR in particolari vettori aperti con estremità 3'-T (il più classico è il P-GEM T EASY).La comodità di questo clonaggio preliminare è dovuta alla sua alta efficienza, alla possibilità di scrinare le colonie col saggio blue/white, e ottieni frammenti arricchiti alle estremità con altri siti di restrizioni che tornano utili per clonaggi successivi. Inoltre come ho scritto sopra, io non digerisco mai direttamente da PCR, perchè non capisci se la reazione avviene o no, mentre se hai un frammento in un vettore, sei perfettamente in grado di capire se c'è stata digestione o meno. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Problema con clonaggio
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